LMNA R482L突变导致C2C12成肌细胞亚群损伤，分化过程中代谢重编程改变和氧化应激

　　

俄罗斯圣彼得堡阿尔马佐夫国家医学研究中心个性化医学研究中心（Research Centre for Personalized Medicine, Almazov National Medical Research Centre）的研究人员 Oksana A. Ivanova、Alexander V. Predeus 等人在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “LMNA R482L mutation causes impairments in C2C12 myoblasts subpopulations, alterations in metabolic reprogramming during differentiation, and oxidative stress” 的论文。这篇论文在探究与 LMNA 基因突变相关的肌肉疾病发病机制领域具有重要意义，为深入理解相关疾病的病理过程提供了关键线索，也为未来开发针对性的治疗策略奠定了基础。

研究背景

LMNA 基因突变引发的邓尼根型经典家族性部分脂肪营养不良（FPLD2）常常累及 R482 残基。FPLD2 患者可能出现肌肉萎缩、肌肉纤维肥大、扩张型心肌病、蛋白尿性肾病、高甘油三酯血症以及胰岛素抵抗等症状，严重时甚至会发展为 2 型糖尿病。在 FPLD2 综合征中，下肢肌肉肥大会伴随肌肉疼痛和运动不耐受，而且肌肉体积的增加与胰岛素敏感性和肌纤维代谢效率呈负相关。目前，虽然提出了多种关于核纤层病（laminopathies，一类由核纤层蛋白基因突变引起的疾病）的发病机制，包括核和细胞结构完整性受损、基因表达异常、DNA 修复缺陷以及前层粘连蛋白 A 的毒性等，但对于 LMNA 基因突变导致骨骼肌功能改变的具体分子机制仍存在争议。

已有研究表明，氧化应激、活性氧（ROS）积累与脂肪细胞、成纤维细胞的病变有关，还可能参与了以脂肪营养不良和早衰为特征的核纤层病的发病过程。骨骼肌细胞对氧化还原稳态的改变十分敏感，遗传性骨骼肌和心脏疾病往往与 ROS 积累和清除的失衡相关。此外，成肌细胞在从增殖状态向分化状态转变的过程中，依赖于代谢重编程，这一过程伴随着线粒体生物合成增加、氧化磷酸化（OXPHOS）相关的 ATP 生成增加以及 ROS 水平上升。适量的 ROS 在成肌细胞分化过程中起着调节信号通路、激活代谢基因的作用，但过量的 ROS 会损害线粒体代谢，降低肌肉细胞活力和分化效率。此前研究虽已发现携带 R482L 突变的 C2C12 小鼠成肌细胞在细胞周期动力学、肌肉分化、线粒体解偶联和糖酵解活性等方面存在改变，但骨骼肌氧化还原状态与 FPLD2 中异常分化之间的确切调控关系仍有待揭示。同时，骨骼肌肌纤维是多核的，每个核的表达模式存在差异，这种差异源于分化成肌细胞的表达异质性。然而，对于经典的 C2C12 成肌细胞系，其异质性的数据非常有限，在骨骼肌细胞功能化过程中，环境的作用、不同成肌细胞群体之间的调节相互作用以及特定亚群在核纤层病发病机制中的作用，都还知之甚少。基于这些未解决的问题，开展此项研究具有重要的必要性。

研究方法

1. 细胞培养与处理：使用慢病毒构建体对小鼠 C2C12 骨骼肌细胞系进行基因改造，使其表达携带 R482L 突变的人类 LMNA 基因（hLMNA），建立稳定细胞系。将未分化、增殖的 C2C12 细胞培养在含有特定成分的增殖培养基中，诱导分化时，更换为含有不同血清浓度的分化培养基，且每天更换。
2. 测序分析：进行单细胞 RNA 测序（scRNA - seq），构建单细胞文库并测序，对原始数据进行处理和分析，鉴定细胞亚群、寻找差异表达基因（DEGs）并进行通路分析。同时，利用已有的批量 RNA 测序（bulk RNA - seq）数据集进行重新分析，重点关注代谢、生物能量学和应激防御相关基因的调控。
3. 功能检测：运用多种实验技术检测细胞的多种功能指标。例如，通过 Seahorse XFe24 通量分析仪和线粒体应激测试程序测量线粒体功能；采用实时 ATP 速率测定法检测 ATP 生成情况；利用荧光探针检测活性氧（ROS）水平；通过实时 PCR 相对定量线粒体 DNA（mtDNA）含量；使用特定探针和系统测定谷胱甘肽（GSH）水平；运用蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫细胞化学技术检测自噬相关蛋白。

研究结果

1. C2C12 成肌细胞单细胞 RNA 测序
   • 细胞亚群鉴定与分析：对转基因 hLMNA - WT 和 hLMNA - R482L 的 C2C12 成肌细胞进行 scRNA - seq，共分析了 9470 个细胞。无监督聚类发现 4 个亚群，分为两个主要的增殖群体：MES（包括 MES - 1 和 MES - 2）和 MYO（包括 MYO - 1 和 MYO - 2）。hLMNA - R482L 成肌细胞中 MES - 2 亚群的细胞比例增加。通过分析各亚群的特征标记基因和相关信号通路，发现 MES 亚群细胞具有间充质和肌成纤维细胞的双重身份，表达细胞外基质蛋白、胶原蛋白等相关基因；MYO - 1 为增殖的成肌细胞，MYO - 2 为成熟的肌细胞，它们分别具有与骨骼肌生长、发育和成熟相关的基因表达特征。
   • 基因表达差异分析：对 hLMNA - WT 和 hLMNA - R482L 成肌细胞进行差异表达分析，发现大多数表达变化发生在 MES 亚群。在 MES - 1 和 MES - 2 中，hLMNA - R482L 上调的 DEGs 大多与结缔组织发育、骨化、生物矿化等相关，同时细胞周期相关基因下调。在 MYO 亚群中，MYO - 2 的氧化应激防御系统相关通路下调，而氧化磷酸化和细胞呼吸相关通路上调。此外，研究还发现许多 DEGs 与细胞代谢和应激反应相关。
   
   
2. hLMNA - R482L C2C12 细胞的氧化还原稳态和自噬失调
   • 氧化应激和自噬相关基因表达变化：重新分析 bulk RNA - seq 数据集，发现 hLMNA - R482L 成肌细胞中与肌生成、骨化、脂肪酸 β - 氧化、类固醇代谢、自噬和氧化应激反应相关的通路上调，细胞周期通路下调。进一步分析发现，与氧化应激相关的 DEGs 大多参与 ROS 积累和清除的调控。
   • ROS 水平和自噬活性检测：测量成肌过程中的 ROS 水平，发现 hLMNA - R482L 成肌细胞和分化的肌管中 ROS 积累增加。同时，通过免疫荧光染色和 Western blot 分析发现，hLMNA - R482L 成肌细胞中的自噬被激活，表现为自噬体标记物 LC3 - II 的积累增加。
   
   
3. 携带 hLMNA - R482L 突变的 C2C12 成肌细胞中谷胱甘肽网络的改变
   • 谷胱甘肽代谢通路变化：利用 GATOM 网络应用程序和 bulk 转录组测序数据，发现 hLMNA - R482L 成肌细胞中与谷胱甘肽（GSH）/ 氧化型谷胱甘肽（GSSG）细胞氧化还原网络直接相关的代谢子模块发生调节。GSEA 分析显示谷胱甘肽代谢过程通路上调，相关 DEGs 在 MES - 1/2 和 MYO - 2 亚群中上调。
   • GSH 水平检测：检测 GSH 水平发现，hLMNA - R482L 成肌细胞中的 GSH 水平显著高于野生型，但在分化的 hLMNA - R482L 肌管中 GSH 水平下降。这表明 hLMNA - R482L 成肌细胞中谷胱甘肽介导的抗氧化防御系统被激活以增加 GSH 的产生，但无法将 ROS 含量稳定在与野生型相同的水平，而在成熟肌管中，应激防御系统可能失效。
   
   
4. 表达 hLMNA - R482L 变异的分化 C2C12 成肌细胞中碳水化合物代谢的调控受到严重影响
   • 基因共调控分析：分析成肌细胞向肌管转变过程中的 bulk RNA - seq 数据，通过似然比检验（LRT）发现 9 组差异共调控基因。其中，第 1 组基因与骨骼肌生长发育相关，在分化过程中表达稳定增加；第 2 组基因在分化早期表达增加，hLMNA - R482L 组在分化后期持续增加，而 hLMNA - WT 组则无此变化；第 9 组基因与碳水化合物代谢和生物能量学相关，在 hLMNA - R482L 组中表达差异显著。
   • 代谢通路变化：对第 9 组基因进行 KEGG 通路分析，发现 hLMNA - R482L 肌管中糖酵解通路的多个基因表达下调，包括两个限速步骤相关的基因。这表明 hLMNA - R482L 肌管生成能量的能力下降，无法为氨基酸和核苷酸的合成以及氧化磷酸化提供足够的底物。
   
   
5. hLMNA - R482L 突变对骨骼肌细胞生物能量学的影响
   • 线粒体功能检测：进行 Seahorse ATP 生成速率测试和线粒体应激测试，结果显示在分化过程中，hLMNA - WT 肌管的线粒体储备能力增加，而 hLMNA - R482L 肌管的线粒体储备能力显著下调，同时质子泄漏增加。这表明 hLMNA - R482L 肌管可能存在底物可用性降低、线粒体网络和单个线粒体复合物活性改变等问题。
   • ATP 生成分析：分析 ATP 生成情况发现，在分化过程中，WT 和 hLMNA - R482L 样本的总 ATP 生成均逐渐减少。在增殖的 hLMNA - R482L 成肌细胞和分化早期，其糖酵解产生的 ATP 比例显著低于 WT，且 hLMNA - R482L 成肌细胞在分化过程中无法实现从糖酵解到氧化磷酸化 ATP 生成的正常转变。
   
   

研究结论与讨论

本研究构建了一个简单的 FPLD2 体外肌肉模型，详细描述了携带 hLMNA - R482L 突变的骨骼肌 C2C12 成肌细胞群体中的变化，并在单细胞水平全面描述了 C2C12 成肌细胞的亚群特征。研究发现，C2C12 成肌细胞存在不同的亚群，分别具有不同的分化命运，如 IMF / 肌成纤维细胞、FAPs、周细胞、NMJ 和 MTJ 细胞等，且亚群之间存在相互作用，对构建功能性的 MTJ 至关重要。LMNA - R482L 相关的改变在所有四个 C2C12 成肌细胞亚群中均有检测到，其中 MES 亚群变化最为显著，这些变化大多与细胞代谢和应激反应相关。

在该模型中，hLMNA - R482L 成肌细胞和肌管中 ROS 积累增加，这与谷胱甘肽应激防御系统的激活有关，但在分化的肌管中，抗氧化防御系统未能有效应对 ROS 的增加，导致氧化还原稳态失衡。同时，hLMNA - R482L 肌管中糖酵解和戊糖磷酸途径（PPP）下调，影响了生物能量学和细胞分化，导致肌肉萎缩。此外，研究还发现 hLMNA - R482L 细胞在分化过程中无法正常维持从糖酵解到氧化磷酸化 ATP 生成的转变，进一步支持了代谢功能障碍与 FPLD2 中骨骼肌异常相关的假设。

这项研究的结果扩展了人们对 FPLD2 患者骨骼肌并发症发展过程中代谢失调和氧化应激作用的认识，为进一步研究核纤层病发病机制的分子机制提供了重要的基础。不过，该研究使用的细胞模型存在一定局限性，如内源性小鼠 Lmna 基因的表达可能影响突变诱导的变化，体外培养环境缺乏体内的细胞间和组织 - 细胞相互作用，分化的体外肌管缺乏收缩活动影响其功能和代谢等。但该模型仍为深入研究提供了有价值的信息，后续可在此基础上开展更深入的研究，分析细胞群体在从增殖成肌细胞到融合成肌细胞和分化肌管转变过程中的动态变化，进一步探究突变相关变化对肌生成分化和骨骼肌功能的影响 。