角化细胞中的AhR-Ovol1-Id1调节轴促进特应性皮炎样皮肤炎症的表皮和免疫稳态

　　

上海皮肤病医院（隶属同济大学医学院）、加州大学欧文分校医学院等单位的研究人员 Zeyu Chen、Morgan Dragan、Peng Sun 等在《Cellular & Molecular Immunology》期刊上发表了题为 “The AhR-Ovol1-Id1 regulatory axis in keratinocytes promotes epidermal and immune homeostasis in atopic dermatitis-like skin inflammation” 的论文。这篇论文在皮肤炎症疾病研究领域意义重大，它揭示了一种全新的调节轴，为特应性皮炎（Atopic Dermatitis，AD）和银屑病等炎症性皮肤病的治疗开辟了新方向。

研究背景

特应性皮炎是一种极为常见的炎症性皮肤病，在儿童中的发病率为 15 - 20%，在成人中也高达 10%。环境过敏原，比如屋尘螨，是引发特应性皮炎的常见诱因，而遗传突变（如 FLG 基因突变）和炎症细胞因子导致的皮肤表皮屏障缺陷则是其显著特征。此外，特应性皮炎患者的皮肤常常被金黄色葡萄球菌大量定植，这进一步加剧了表皮屏障和免疫缺陷，使得病情不断恶化。

在特应性皮炎的发病机制中，2 型免疫反应起着关键作用，它由辅助性 T 细胞 2（Th2）相关细胞因子（如 IL - 4 和 IL - 13）的产生以及嗜酸性粒细胞 / 肥大细胞的激活所驱动，会破坏表皮屏障，引发炎症和瘙痒等症状。近年来，越来越多的证据表明，3 型免疫反应，即由 Th17 相关细胞因子（如 IL - 17A）的产生和中性粒细胞的募集所介导的免疫反应，也参与了特应性皮炎的发展，尤其是在一些特定患者群体中。

目前，针对 IL - 4/IL - 13 的生物制剂和针对 JAK/STAT 信号通路的小分子抑制剂在治疗特应性皮炎方面有一定疗效，但并非对所有患者都有效。因此，深入了解特应性皮炎相关的屏障失调和炎症的分子与细胞机制，寻找新的治疗靶点，显得尤为迫切。

芳基烃受体（Aryl hydrocarbon receptor，AhR）作为一种环境感应受体和配体激活的转录因子，在皮肤免疫稳态和屏障维持中发挥着重要作用，已成为特应性皮炎和银屑病治疗的潜在靶点。AhR 激动剂他扎罗汀已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗银屑病，并且正在进行治疗特应性皮炎的临床试验。然而，AhR 在皮肤中的细胞和分子靶点以及其激活后的具体作用机制仍不明确，这限制了相关药物的进一步研发和应用。

研究方法

1. 细胞培养与转染：研究人员培养了正常人表皮角质形成细胞（NHEKs），并按照制造商的方案，使用 Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂将针对 AHR 或 OVOL1 的特异性干扰 RNA（siRNA）转染到细胞中，以沉默相关基因的表达。

2. 动物模型构建：构建了多种基因工程小鼠模型，包括皮肤上皮特异性 Ovol1 敲除小鼠（SSKO，）、小鼠、小鼠等。通过与 K14 - Cre 小鼠杂交，获得了在角质形成细胞中条件性敲除 Ahr 基因的小鼠。利用这些小鼠，建立了两种特应性皮炎小鼠模型：一种是通过在小鼠皮肤上涂抹屋尘螨提取物（HDM）和金黄色葡萄球菌肠毒素 B（SEB）进行致敏；另一种是使用维生素 D3 类似物 MC903 局部涂抹小鼠耳朵诱导发病。此外，还建立了体外人特应性皮炎模型，从健康个体的皮肤活检组织中获取样本，在含有不同处理因素的培养基中进行培养。

3. 体内处理实验：对小鼠进行了多种体内处理实验。例如，通过腹腔注射给予小鼠 FICZ（一种 AhR 激动剂）、γδTCR 抗体（用于阻断 γδT 细胞功能）、IL - 1R 抗体（用于阻断 IL - 1 信号通路）以及 AGX51（一种可诱导 Id1 蛋白降解的小分子化学抑制剂），观察这些处理对小鼠皮肤炎症和相关指标的影响。

4. 检测技术：运用了多种检测技术来分析实验结果。通过染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链反应（ChIP - qPCR）和染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq）技术，确定蛋白与 DNA 的结合情况；利用实时定量聚合酶链反应（RT - qPCR）检测基因表达水平；采用免疫荧光染色、RNAscope 等技术对蛋白和 RNA 进行定位和定量分析；通过流式细胞术对皮肤中的免疫细胞进行分析；还进行了组织学染色（如 H&E 染色）来观察皮肤组织的病理变化。

研究结果

1. AhR 直接激活 OVOL1 表达并影响角质形成细胞功能：研究人员发现，在培养的 NHEKs 中，化学激活 AhR 能够上调 OVOL1 的表达。通过对 OVOL1 启动子序列的分析，发现其中存在多个 AhR 结合基序（GCGTG）。ChIP - qPCR 实验证实，AhR 能够与这些位点结合，就像它与已知的下游靶基因 CYP1A1 结合一样。当使用 siRNA 沉默 AHR 表达时，不仅 AHR 的经典靶基因 CYP1A1 和 CYP1B1 的表达显著下调，OVOL1 的 mRNA 表达也明显降低，这表明 OVOL1 是人类角质形成细胞中内源性 AhR 蛋白的直接转录靶点。

进一步研究发现，AhR 激动剂 FICZ 处理 NHEKs 后，会导致一些基因表达发生变化。当敲低 OVOL1 时，FICZ 诱导的基因表达变化出现了改变，部分基因的表达模式发生了逆转。例如，FICZ 原本诱导的与表皮分化和脂质代谢相关的基因表达上调，在 OVOL1 敲低后受到抑制；而与细胞周期相关的基因表达下调趋势也被逆转。这表明 OVOL1 在 AhR 调节角质形成细胞基因表达过程中起着关键作用，AhR 激活后需要 OVOL1 来促进与表皮分化和脂质代谢相关基因的表达，同时抑制细胞周期相关基因的表达，从而使角质形成细胞从增殖状态转变为分化状态。
2. AhR 激活 Ovol1 表达并依赖 Ovol1 发挥体内功能：通过分析已发表的小鼠原代角质形成细胞的 AhR ChIP - seq 数据，研究人员发现 AhR 能够直接结合小鼠 Ovol1 的启动子。对和小鼠原代角质形成细胞的 RNA - seq 数据分析显示，小鼠中 Cyp1b1 和 Ovol1 的表达显著降低。这表明在小鼠中，AhR 对 Ovol1 的直接激活作用在进化上可能是保守的。

为了探究 Ovol1 对 AhR 促进皮肤屏障功能的重要性，研究人员给 SSKO 小鼠和对照小鼠腹腔注射 FICZ 或 DMSO，并同时用 HDM/SEB 处理。结果发现，FICZ 能够在对照小鼠中挽救皮肤屏障功能障碍和表皮增生，且能上调 Cyp1a1、Cyp1b1 和 Ovol1 的表达。然而，在 SSKO 小鼠中，FICZ 无法逆转皮肤屏障功能的恶化，且对 Cyp1b1 的诱导上调作用消失。这说明 AhR 在体内激活靶基因和促进皮肤屏障功能的过程中，依赖于角质形成细胞中 Ovol1 的表达。
3. Ovol1 保护皮肤免受特应性皮炎样病理影响：分析已发表的健康个体和特应性皮炎患者全皮肤样本的单细胞 RNA - seq 数据，研究人员发现特应性皮炎患者角质形成细胞中 OVOL1 的表达下调，尤其是在病变皮肤中。原位检测也证实了这一结果。在小鼠实验中，敲除 Ovol1 基因后，HDM/SEB 诱导的表皮表型明显加重，表现为皮肤屏障破坏更严重、表皮增生更明显，皮肤的经表皮水分流失（TEWL）值升高，临床症状评分也显著增加。即使在长期（3 轮）暴露于 HDM 和 SEB 后，Ovol1 缺失导致的皮肤病理变化仍然存在，这表明 Ovol1 对皮肤的保护作用具有持续性。

此外，在稳态条件下，SSKO 小鼠的 TEWL 值也有轻微但显著的增加。在另一种特应性皮炎模型（MC903 诱导的模型）中，SSKO 小鼠的皮肤症状更严重，耳朵更厚，血清中与中性粒细胞募集或成熟相关的因子 Cxcl2 和 G - CSF 水平显著升高，且在皮肤中观察到更多的中性粒细胞浸润。这些结果表明，Ovol1 在多种实验模型中都能抑制特应性皮炎样皮肤病理变化，无论是在急性还是慢性刺激下，都能有效预防局部和全身性的不良影响。
4. 确定 Ovol1 在特应性皮炎样皮肤中的下游靶点：为了探究 Ovol1 保护皮肤的具体机制，研究人员对小鼠原代角质形成细胞进行了 ChIP - seq 分析。结果发现，大量的 Ovol1 结合峰位于基因启动子区域，约 50% 的结合位点含有其保守结合基序（CCGTTA），部分位点还含有 E2F 转录因子结合基序（TTTTCGCG），这表明 Ovol1 可能通过与 E2F 序列结合或通过 E2F/Rb 复合物被招募到其靶基因启动子上。

Metascape 分析显示，Ovol1 结合的基因主要参与了管形态发生、细胞投射组织调节、细胞骨架组织调节、mRNA 稳定性调节、细胞器组织正调节和细胞周期过程调节等生物学过程。进一步研究发现，Ovol1 能够直接结合多个角蛋白基因，如 Krt5、Krt14 和 Krt10。在 HDM/SEB 处理的 SSKO 小鼠中，Krt14 的表达显著增加，而终末分化标记物丝聚蛋白（filaggrin）的表达则明显降低，这表明 Ovol1 缺失的角质形成细胞可能由于 Krt14 表达的失控，而停滞在祖细胞 / 早期分化状态。

通过交叉分析 Ovol1 ChIP - seq 数据和 OVOL1 敲低或 Ovol1 缺失时上调的基因，研究人员确定了一些潜在的 Ovol1 靶基因，其中 Aqp3 和 Id1 受到重点关注。ChIP - seq 和 ChIP - qPCR 结果显示，Ovol1 能够结合 Aqp3 和 Id1 的调控区域。在 HDM/SEB 处理的 SSKO 小鼠中，Aqp3 和 Id1 的表达均显著增加。此外，在 FICZ 处理的 NHEKs 中，敲低 OVOL1 会导致 Aqp3 和 Id1 的表达进一步增加，这表明 Ovol1 在调节与细胞骨架、活性氧和细胞增殖相关的基因表达中发挥着直接作用，并且暗示了存在一个保守的 AhR - Ovol1 - Aqp3/Id1 调节轴。
5. Id1 调节特应性皮炎样皮肤的表皮屏障完整性和中性粒细胞积累：为了验证 Id1 异常增强的表达是否会导致 SSKO 小鼠皮肤屏障破坏和病理变化，研究人员使用了 AGX51 来抑制 Id1 的功能。结果发现，与 DMSO 对照组相比，腹腔注射 AGX51 能够显著降低 HDM/SEB 处理的 SSKO 小鼠的 TEWL 值和表皮厚度，改善其临床症状评分。在野生型（WT）小鼠中，AGX51 处理也能降低 TEWL 值和表皮厚度，这表明 Id1 是 Ovol1 在特应性皮炎相关表皮屏障缺陷和皮肤病理中的重要功能靶点。

对 SSKO 小鼠和对照小鼠皮肤的免疫细胞分析发现，在 HDM/SEB 刺激下，SSKO 小鼠皮肤中的中性粒细胞、树突状细胞（DCs）、细胞、总 T 细胞和真皮 γδT 细胞数量显著增加，而朗格汉斯细胞（LCs）、树突状表皮 T 细胞（DETCs）、巨噬细胞、T 细胞、T 细胞和固有淋巴细胞（ILCs）的数量没有明显变化。使用 AGX51 处理后，HDM/SEB 处理的 SSKO 小鼠和 WT 小鼠皮肤中的中性粒细胞数量显著减少，而其他免疫细胞的数量不受影响。这表明 Id1 在调节特应性皮炎样皮肤中 Ovol1 下游的中性粒细胞积累方面发挥着特定作用。
6. IL - 1 信号促进真皮 γδT 细胞积累和特应性皮炎样皮肤病理变化：在特应性皮炎样 SSKO 小鼠皮肤中，真皮 γδT 细胞数量显著增加。为了探究这些细胞在 Ovol1 缺失诱导的屏障失调和炎症中的作用，研究人员使用 γδTCR 抗体阻断 γδT 细胞功能。结果发现，γδTCR 抗体几乎完全阻止了真皮 γδT 细胞和 DETCs 的流式细胞术检测，并且显著缓解了 SSKO 小鼠的特应性皮炎样皮肤表型，如临床症状评分降低、表皮和真皮厚度减小，但对表皮屏障功能的恢复作用不明显。在 WT 小鼠的特应性皮炎样皮肤中也观察到了类似的效果。这表明真皮 γδT 细胞在特应性皮炎样皮肤中，在表皮 / 屏障失调下游协调先天免疫和适应性免疫反应中起着关键作用。

进一步研究发现，SSKO 小鼠病变皮肤中 Il1a 和 Il1b 的表达上调，尤其是 Il1a 在表皮中的表达显著增加。使用 IL - 1R 抗体阻断 IL - 1 信号通路后，HDM/SEB 处理的 SSKO 小鼠皮肤中的真皮 γδT 细胞数量减少了约 2.5 倍，同时特应性皮炎样皮肤缺陷得到明显改善，如临床症状评分降低、表皮厚度减小。在 WT 小鼠中，IL - 1R 抗体处理也能减少真皮 γδT 细胞浸润和表皮增生。这表明 IL - 1 信号在特应性皮炎样皮肤中，在屏障失调下游促进真皮 γδT 细胞积累和相关病理变化中发挥着重要作用。
7. OVOL1 和 ID1 功能在人类特应性皮炎皮肤中的相关性：对 Ovol1 ChIP - seq 数据和已发表的人类特应性皮炎表皮 RNA - seq 数据进行交叉分析，研究人员发现了 125 个 Ovol1 靶基因的人类同源物，其中 AQP3 和 ID1 在特应性皮炎表皮中的表达显著增加。免疫染色实验也证实了 AQP3 和 ID1 蛋白在特应性皮炎表皮角质形成细胞中的表达明显增强。

在体外实验中，使用 ID1 抑制剂 AGX51 处理来自健康个体皮肤活检的外植体培养物，发现 AGX51 能够显著增加一些经典 ID1 靶基因（如细胞周期调节因子 CDKN1A、CDKN2A 和 CDKN2B）的表达。在建立的体外人特应性皮炎样皮肤模型中，AGX51 处理能够抑制由细胞因子鸡尾酒（M6）诱导的中性粒细胞趋化因子 CXCL1 和 CXCL2 的表达，并且略微但显著地增加 OVOL1 的表达。这表明在人类特应性皮炎皮肤中，OVOL1 靶基因 ID1 的活性升高可能通过促进中性粒细胞积累，在皮肤炎症中发挥作用。

此外，对银屑病患者的皮肤活检样本分析发现，其皮肤病变中 AhR 蛋白和 OVOL1 mRNA 的表达降低，而 AQP3 和 ID1 蛋白的表达增加，这与在人类特应性皮炎皮肤病变中的发现相似，提示 AhR - OVOL1 - ID1 轴的失调可能是特应性皮炎和银屑病的共同特征。

研究结论与讨论

这项研究揭示了角质形成细胞中 AhR - Ovol1 - Id1 调节轴在维持表皮和免疫稳态中的关键作用。在特应性皮炎样皮肤炎症中，AhR 激活后直接促进 OVOL1 的表达，OVOL1 进而影响 AhR 对基因表达的调控，使角质形成细胞从增殖状态转变为分化状态，增强皮肤屏障功能，并调节免疫反应。Ovol1 通过抑制其下游靶基因 Id1 等的表达，防止表皮过度增生、维持屏障完整性和抑制炎症反应。Id1 的异常表达会导致皮肤屏障破坏和中性粒细胞积累增加，加重特应性皮炎的症状。此外，研究还发现真皮 γδT 细胞和 IL - 1 信号在特应性皮炎样皮肤炎症中起着重要作用，它们在 Ovol1 缺失导致的屏障失调下游，促进炎症反应和病理变化。

该研究的重要意义在于，首次明确了 AhR - Ovol1 - Id1 调节轴在特应性皮炎发病机制中的关键作用，为开发针对特应性皮炎和银屑病等炎症性皮肤病的新型治疗方法提供了潜在的靶点。以往针对 AhR 的治疗可能会因为其在免疫细胞中的复杂作用而产生不良反应，而靶向 OVOL1 相关的细胞和分子成分，有望在有效治疗疾病的同时，减少这些不良反应。此外，研究还发现了一些之前未被认识到的在皮肤炎症和特应性皮炎发病机制中起作用的因素，如 ID1 在促进炎症和中性粒细胞反应中的作用，以及真皮 γδT 细胞和 IL - 1 信号在调节免疫反应中的新机制，这为深入理解皮肤炎症性疾病的发病机制提供了新的视角，也为未来进一步研究和治疗这些疾病奠定了坚实的基础。