突破性发现！中国台州地区 HPV31 和 HPV35 E6/E7 癌基因遗传变异及致癌性深度解析

为探究 HPV31 和 HPV35 的遗传变异及致癌性，绍兴大学医学院等单位的研究人员开展相关研究，分析其 E6/E7 基因变异、构建进化树等。结果揭示多种变异体特征。该研究为 HPV 防治和疫苗研发提供关键依据，值得一读。

　　

绍兴大学医学院（School of Medicine, Shaoxing University）的研究人员郝博?袁（Hao-Bo Yuan）、于俊辉（Jun-Hui Yu）等人在《病毒学杂志》（Virology Journal）上发表了题为《中国台州地区 HPV31 和 HPV35 E6/E7 癌基因的遗传变异及致癌性分析》（Genetic variations and carcinogenicity analysis of E6/E7 oncogenes in HPV31 and HPV35 in Taizhou, China）的论文。这篇论文对于深入了解人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）的遗传变异、HPV 与宫颈癌发生的关系，以及推动适合中国女性的多价 HPV 疫苗和诊断方法的研发有着重要意义。

一、研究背景

宫颈癌严重威胁着女性的健康。2022 年，全球约有 66 万新发病例，35 万人因此死亡。在中国，宫颈癌的发病率和死亡率呈上升趋势，农村地区尤为明显。高危型人乳头瘤病毒（High-Risk Human Papillomavirus，HR-HPV）的持续感染是引发宫颈癌的主要病因。HPV 是一种小型双链 DNA 病毒，其基因组约由 8000 个核苷酸组成，早期基因 E6 和 E7 编码的主要致癌蛋白，在肿瘤的发生和发展中起着关键作用。

HPV 可根据潜在致癌性分为高危型和低危型，其中 14 种 HPV（如 HPV16、18、31、35 等）被定义为 HR-HPV 。而且，每种 HPV 类型还可依据基因差异进一步分为不同的变异谱系和亚谱系。此前的研究发现，HPV 基因组的不同遗传变异在致癌风险上存在差异，比如 HPV16 的 A4（亚洲）亚谱系变异体相比 A1 - 3（欧洲）变异体，患 CIN2 +（宫颈上皮内瘤变 2 级或更严重病变，Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 2 or Worse）的风险显著增加 ；HPV58 的 E7 癌蛋白中具有 T20I/G63S 替代的 A3 亚谱系变异体，相比其他变异体，CIN2 + 风险更高。

尽管 HPV31 和 HPV35 也可能引发宫颈癌，但关于它们的相关遗传变异及其致癌性的研究却很少。因此，本次研究旨在探究 HPV31 和 HPV35 的 E6/E7 基因的遗传变异，对台州地区流行的 HPV31 和 HPV35 进行流行病学分析，并评估它们与宫颈病变的相关性。

二、研究方法

1. 研究人群和样本采集：2013 年 2 月至 2023 年 6 月，研究人员从浙江省台州医院采集了前来进行宫颈癌筛查的女性的宫颈脱落细胞。为确保实验准确性，仅选取了单独感染 HPV31 或 HPV35 的样本，最终共选取了 150 个 HPV31 单阳性样本和 133 个 HPV35 单阳性样本。样本保存在细胞保存液中，于 -80℃储存，等待提取 DNA。
2. HPV 基因分型：运用 DNA 提取试剂盒（#GK0122, GENEray）从储存的样本中提取总 DNA，采用基于磁珠的多重 bioGP5+/6 + PCR/MPG 检测技术进行 HPV 基因分型。该技术利用生物素标记的 PCR 产物与附着在彩色编码磁珠上的 HPV 型特异性探针结合，以链霉亲和素 - 藻红蛋白作为报告分子，通过 Luminex200?分析仪分析 HPV 基因型，可同时检测 27 种 HPV 基因型。
3. 引物设计和 PCR：借助 NCBI 引物 - BLAST 工具，针对 HPV31 或 HPV35 的整个 E6/E7 区域设计特异性引物对。HPV31 E6/E7 的引物由 BGI 公司（中国杭州）合成，序列分别为 31E6E7F 5′-AGGGA G TGA CCGAAAGTGG T - 3′和 31E6E7R 5′-ATGTTCC TCCGCTTCC TGTG - 3′；HPV35 E6/E7 的引物序列为 35E6E7F 5′-AGTGA CCGAAAACGGTCGTA - 3′和 35E6E7R 5′-GGATCCCCCGTACGTCTACT - 3′。
4. 测序：以 GenBank 中 HPV31（登录号：J04353）和 HPV35（登录号：HQ537708）的参考序列为标准，HPV31 扩增的 PCR 产物大小为 1066bp，对应核苷酸位置 30 - 1095，包含整个 E6 基因（108 - 557nt）和 E7 基因（560 - 856nt）；HPV35 扩增产物大小为 944bp，对应核苷酸位点 19 - 962，包含整个 E6 基因（110 - 559nt）和 E7 基因（562 - 861nt）。对 PCR 产物进行常规的纯化、可视化和测序，所有数据均通过至少两次重复的 PCR 扩增和序列分析进行确认。
5. 系统发育分析：运用 ClustalW 多重比对（BioEdit 比对编辑器软件 V7.0.9.0），将获得的所有核苷酸序列与原型参考序列（HPV31 为 J04353，HPV35 为 HQ537708）进行比对。使用 MEGA - X 软件 V10.1.7，基于 GTR 模型构建最大似然树。对数据进行 1000 次自展重抽样，评估树的拓扑结构。
6. 统计分析：使用 SPSS 25.0 软件对数据进行分析，通过卡方检验或 Fisher 精确检验分析宫颈病变风险与 HPV31 或 HPV35 变异体之间的关系。以 CIN2 + 为结局变量，正常组织学为对照组，计算比值比（Odd Ratios，ORs）和 95% 置信区间（95% Confidence Intervals，95% CI），双侧 P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

三、研究结果

1. 研究人群特征：HPV31 和 HPV35 在中国女性中的感染率极低，单独或与其他类型合并感染的感染率分别约为 7.0% 和 5.5% 。本次研究中，检测到 150 名女性单独感染 HPV31（中位年龄 42.0 岁，年龄范围 20 - 69 岁），133 名女性单独感染 HPV35（中位年龄 44.0 岁，年龄范围 21 - 71 岁）。在 HPV31 感染人群中，148 人（98.7%）成功获得了完整的 E6 和 E7 基因序列，其中 80 人（54.1%）进行了阴道镜活检组织学诊断，包括 46 例正常组织学、8 例 CIN1、14 例 CIN2、12 例 CIN3，无宫颈癌病例；在 HPV35 感染人群中，121 人（91.0%）成功获得了完整的 E6 和 E7 基因序列，79 人（65.3%）进行了阴道镜活检组织学诊断，包括 61 例正常宫颈、6 例 CIN1、8 例 CIN2、4 例 CIN3，无宫颈癌病例。
2. HPV31 E6 和 E7 基因变异：与 J04353 相比，所有 HPV31 样本均出现核苷酸变异，但未发现提前终止密码子或移码突变。研究共获得 16 种不同的 HPV31 基因变异体，命名为 31CNTZ01 - 31CNTZ16，并提交至 GenBank 数据库，登录号为 OR540563 - OR540578。其中，31CNTZ07（27.7%，41/148）是最常见的变异体，其次是 31CNTZ15（25%，37/148）和 31CNTZ04（19.6%，29/148）。31CNTZ04 的氨基酸变异序列与 31CNTZ07 一致，16 种变异体中有 7 种（43.8%，7/16）是新型 HPV31 E6/E7 变异体。在 HPV31 E6/E7 区域共鉴定出 24 个单核苷酸替换，其中 12 个（50.0%，12/24）为非同义替换（即 DNA 序列中的单核苷酸替换导致编码氨基酸发生改变），7 个（29.2%，7/24）为新发现的替换。部分此前未报道的核苷酸替换包括 A299G（T64A）、A320G 等。
3. HPV35 E6 和 E7 基因变异：与 HQ537708 相比，所有 HPV35 样本均有核苷酸变异，且无提前终止密码子或移码突变。研究得到 5 种不同的 HPV35 基因变异体，命名为 35CNTZ01 - 35CNTZ05，提交至 GenBank 数据库，登录号为 OR540579 - OR540583。35CNTZ01（62.0%，75/121）和 35CNTZ03（33.1%，40/121）是最常见的变异体，二者氨基酸变异序列一致，5 种变异体中有 1 种（20.0%，1/5）为新型 HPV35 E6/E7 变异体。在 HPV35 E6/E7 区域共鉴定出 7 个单核苷酸替换，其中 2 个（28.6%，2/7）为非同义替换，1 个（14.3%，1/7）为新发现的替换，如 A274G 此前未被报道。
4. 系统发育构建：构建 HPV31 的系统发育树发现，其变异体属于 A2、B1、C2 和 C3 亚谱系，台州地区未检测到 A1、B2 或 C1 亚谱系。A2 亚谱系（57.4%，85/148）最为常见，其次是 C2（26.4%，39/148）、C3（14.2%，21/148）和 B1（2.0%，3/148）。构建 HPV35 的系统发育树显示，所有 HPV35 E6/E7 变异体均属于 A 谱系，其中 99.2%（120/121）属于 A1 亚谱系。
5. 与宫颈病变的风险关联：数据显示，HPV31 的 A2 亚谱系中 CIN2 + 患者的比例高于其他亚谱系，但差异无统计学意义（69.2% vs. 30.8%，P>0.05）。A2 亚谱系中最常见的变异体 31CNTZ07 与其他 A2 变异体相比，CIN2 + 风险更高（OR = 3.5，95% CI = 1.31 - 9.36；P<0.05）。在 HPV35 方面，35CNTZ01 和 35CNTZ03 是最常见的变异体，但二者致癌能力无显著差异（P<0.05）。此外，HPV31 或 HPV35 E6/E7 变异体的核苷酸替换与宫颈病变风险之间未观察到显著趋势。

四、研究结论与讨论

本研究首次对中国台州地区 HPV31 和 HPV35 的遗传变异、系统发育关系和致癌潜力进行了全面调查。研究结果为 HPV31 和 HPV35 的地理 / 种族分布、遗传变异、系统发育关系及其致癌潜力提供了有价值的数据，有助于开发适合中国女性的多价 HPV 疫苗和诊断方法。

从 HPV31 的研究结果来看，其变异体在不同地区的分布存在差异。在中国，各地区 HPV31 变异体的分布趋势相似，A2 亚谱系占多数；而在其他国家和地区，如日本、伊朗、巴西、意大利等，HPV31 变异体的优势亚谱系有所不同，这表明地理差异和种族差异会影响 HPV31 变异体的分布。同时，A2 亚谱系中 CIN2 + 的比例相对较高，且 31CNTZ07 变异体与更高的 CIN2 + 风险相关，这在一定程度上解释了为什么部分 HPV31 感染会自发消退，而部分会导致疾病进展。

对于 HPV35，虽然在亚洲、欧洲和北美不常见，但在非洲是最流行的高危型 HPV。本研究中，台州地区的 HPV35 变异体均属于 A 谱系，其中 99.2% 属于 A1 亚谱系，这与其他一些国家的研究结果相符。不过，在非洲裔美国女性中，A2 亚谱系与 CIN3 + 显著相关，非洲女性感染 HPV35 后 CIN3 的患病率可增加高达 10 倍 。而在台州地区，HPV35 变异体与宫颈病变无显著相关性。目前 9 价 HPV 疫苗（9vHPV）未涵盖 HPV35，鉴于 HPV35 在非洲的流行情况，将其纳入 HPV 疫苗对于非洲地区的宫颈癌防控可能非常有帮助。

当然，本研究也存在一些局限性。由于台州地区 HPV31 和 HPV35 的自然发病率极低，单阳性样本数量有限，不过这已是目前中国东南地区研究样本量最大的；研究基于部分序列（E6 和 E7 癌基因）定义 HPV 变异体，而非全基因组，但这似乎未导致变异谱系的错误分类；此外，研究缺乏纵向数据来评估遗传变异与感染持续性之间的关系，研究团队计划在未来的研究中对此进行评估。

总体而言，这项研究为 HPV 相关研究和宫颈癌防控提供了重要的参考依据，对推动相关领域的发展具有积极意义。未来还需要更多的研究来进一步深入了解 HPV 的遗传变异和致癌机制，从而更好地预防和控制宫颈癌的发生。