前沿探索：白藜芦醇如何精准调控小鼠成牙骨质细胞 ERK 与 AKT 磷酸化，改写正畸治疗新格局？

为解决正畸治疗中炎症性牙根吸收等副作用问题，德国亚琛工业大学医学院正畸科研究人员研究白藜芦醇对小鼠成牙骨质细胞（OCCM-30）的作用。发现其可调节 pAKT 和 pERK 且促细胞活力，为正畸治疗提供新思路，值得科研人员一读。

　　

德国亚琛工业大学医学院正畸科（Department of Orthodontics, Medical Faculty, RWTH Aachen University）的研究人员在《BMC Oral Health》期刊上发表了题为 “Resveratrol modulates phosphorylation of ERK and AKT in murine cementoblasts during in vitro orthodontic compression” 的论文。这篇论文在口腔正畸学领域意义重大，为探索正畸治疗副作用的防治方法提供了新的思路，有望改善正畸治疗效果，减少患者痛苦。

摘要解读

该研究聚焦于白藜芦醇（Resveratrol）对机械刺激的小鼠成牙骨质细胞（OCCM - 30，murine cementoblasts cell line）的影响。白藜芦醇是一种具有抗炎和促再生特性的植物多酚。研究发现，白藜芦醇能以时间和剂量依赖的方式提高 OCCM - 30 细胞的活力，同时显著降低 pERK 和 pAKT（细胞代谢关键通路的上游调节因子）的上调。此外，研究首次发现成牙骨质细胞在受到压缩刺激时，会加速 STAT3（信号转导和转录激活因子 3，Signal transducer and activator of transcription 3）的激活，并增加 NF - κB p65（核因子 κB，Nuclear factor kappa B）向细胞核的转位。这表明白藜芦醇可能有潜力调节牙周组织对机械刺激的反应，为正畸治疗中相关副作用的控制带来希望。

研究背景

在正畸治疗中，施加正畸力会使牙齿在牙槽骨内移动，这一过程会导致牙周膜（Periodontal ligament，PDL）部分区域受压、部分区域受拉伸。这种机械刺激会引发无菌性炎症，进而启动牙周组织的重塑，实现牙齿移动。然而，这种炎症反应若失衡或过度，就会引发一系列并发症。其中，正畸诱导的炎症性牙根吸收（Orthodontically induced inflammatory root resorption）较为常见，约 80% 的患者会出现这种情况，严重者根尖吸收超过 4 毫米的比例可达 15%。

目前认为，当受压区的透明样变区域被清除时，就可能引发炎症性牙根吸收。在这个过程中，破骨细胞会释放溶骨酶，导致牙根发生病理性降解。而且，施加的正畸力越大，牙根吸收越严重。另外，成牙骨质细胞在正畸过程中扮演着重要角色，在不同的机械刺激强度下，它既可能促进破骨细胞前体的募集和激活，也可能发挥保护作用，抑制炎症性牙根吸收。同时，成牙骨质细胞还能在压力减轻或中断时，通过沉积内源性纤维牙骨质来修复吸收陷窝。

为了减少正畸治疗的并发症，人们尝试了多种临床方法，如皮质切开术、激光治疗、振动治疗以及生物调节剂的使用等。这些方法的目的都是通过调节 RANKL - OPG 系统（RANKL，核因子 κB 受体激活剂配体，receptor activator of nuclear factor kappaligand；OPG，骨保护素，osteoprotegerin），来调控炎症反应，尤其是破骨细胞和成骨细胞的活性。

白藜芦醇作为一种天然存在的多酚，在植物中发挥着抵御感染和应激的作用。它因与 “法国悖论”（French paradox）相关而备受关注，虽然其对心血管疾病的保护作用假说尚未得到证实，但它具有的抗炎、抗氧化和免疫调节等多种特性，使其在多个领域的研究中都备受瞩目。在正畸领域，白藜芦醇有望成为一种生物调节剂，影响牙周压缩区的成牙骨质细胞，从而减轻炎症性牙根吸收，这也是本次研究开展的重要原因。

研究方法

1. 细胞培养：研究选用 OCCM - 30 细胞，在含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 低糖细胞培养基中，于 37°C、5% 饱和及 95% 湿度的条件下进行培养。在细胞达到一定汇合度后，分别用不同浓度的白藜芦醇（溶解于 DMSO）处理细胞，对照组则仅用 DMSO 处理。
2. 静态压缩刺激：采用 Kanzaki 等人的模型，在细胞单层达到 90% 汇合度且给药 1 小时后，对细胞施加的静态压缩力 16 小时（免疫荧光实验中压缩时间为 3 小时），以此模拟体外压缩区的环境。
3. MTS 测定：使用 CellTiter One Solution Cell Proliferation Assay 检测不同浓度白藜芦醇处理 24、48 和 72 小时后 OCCM - 30 细胞的活力，通过测量细胞代谢产生的甲臜染料量来评估细胞活力，结果以相对于 0 μM 对照组的平均值进行归一化处理。
4. 划痕实验评估细胞迁移：在施加白藜芦醇 1 小时后，用 200 μL 移液器头在细胞单层上划痕，分别在划痕后 0、12 和 24 小时拍照，测量划痕宽度并计算细胞生长距离，以此评估 OCCM - 30 细胞的迁移能力。
5. RNA 提取与纯化：在药物和压力处理后，用 PBS 洗涤细胞，再用 TRIzol 试剂裂解细胞以提取 RNA。通过 NanoDrop 检测 RNA 的产量和纯度，并使用 QuickRNA MicroPrep Kit 进行 RNA 纯化，确保实验结果的准确性。
6. 定量实时荧光定量 PCR 分析（RT - qPCR）：将纯化后的 RNA 逆转录为 cDNA，使用 Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix 和自行设计的引物进行 RT - qPCR，以 Rpl22 作为内参基因，检测 Il - 6（白细胞介素 6，Interleukin 6）和 Cox2（细胞色素 c 氧化酶亚基 2，Cytochrome c oxidase subunit 2）的基因表达水平，结果以相对于对照组的倍数变化表示。
7. 蛋白质免疫印迹（Western blot）：用 RIPA 缓冲液（添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂）裂解经白藜芦醇处理和压力刺激后的细胞，提取总蛋白。通过 Bradford 法测定蛋白浓度后，进行凝胶电泳分离蛋白，并转移至硝酸纤维素膜上。使用特定的一抗和二抗进行孵育，通过 ChemiDoc MP Imaging System 和 Image Lab Software 进行荧光可视化、定量和归一化分析，检测 AKT、ERK 1/2、STAT3 及其磷酸化形式的蛋白表达水平。
8. 免疫荧光：在药物和压力处理完成后，对细胞进行固定、通透和封闭处理，然后分别加入 NF - κB p65 的一抗和携带荧光的二抗，并用罗丹明鬼笔环肽染色细胞骨架，用含有 DAPI 的 ProLong Gold Antifade Mountant 封片。通过显微镜观察并计算 NF - κB p65 转位到细胞核的面积占总细胞核面积的百分比，以此评估其核转位情况。
9. 统计分析：实验数据以平均值 ± 标准差（SD）表示，通过 Shapiro - Wilk 检验评估数据的正态性，使用单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 多重比较检验进行统计学分析，span data-custom-copy-text="\(p 0.05\)"被认为具有统计学意义。

研究结果

1. 白藜芦醇以时间和剂量依赖的方式增强成牙骨质细胞活力：通过 MTS 测定发现，较低剂量（0.1 和 0.3 μM）的白藜芦醇在处理细胞 24 小时后，能显著提高 OCCM - 30 细胞的活力。在不同时间点和浓度下，除最高浓度（10 μM）在 72 小时处理时出现非显著的细胞活力下降外，其他浓度均呈现出促进细胞活力的趋势，且这种促进作用在较短暴露时间和较低浓度时更为明显，同时未观察到明显的细胞毒性。
2. 白藜芦醇对细胞迁移无显著影响：基于划痕实验，在 0、12 和 24 小时观察发现，对照组细胞在 24 小时的迁移距离几乎是 12 小时的两倍，说明 OCCM - 30 细胞在模拟伤口愈合过程中以近似恒定的速率迁移。而 10 μM 白藜芦醇处理组对细胞迁移没有显著影响，仅在两个时间点均呈现出再生速率降低的非显著趋势。
3. 白藜芦醇倾向于抑制机械刺激引起的 Il - 6 基因表达上调：RT - qPCR 结果显示，成牙骨质细胞在受到 16 小时的压力刺激后，Il - 6 基因表达显著上调。白藜芦醇处理后，虽能逆转这种上调趋势，但未降至对照组水平，且对 Cox2 基因的基础表达和压力诱导的表达均无显著影响。
4. 白藜芦醇抑制 OCCM - 30 细胞受压刺激诱导的 ERK 和 AKT 磷酸化：Western blot 分析表明，在无压缩力时，ERK 和 AKT 的磷酸化水平无明显变化；90% 汇合度的细胞经 16 小时压缩刺激后，pERK 1/2 和 pAKT 显著增加。而 10 μM 白藜芦醇处理能显著下调 pERK 1 和 pAKT，使 pAKT 水平恢复至基线条件，pERK 2 虽有下降但无统计学意义。同时，这些蛋白的非磷酸化形式随着压缩时间增加而减少，GAPDH 水平在所有样本中保持一致，表明实验的归一化处理可靠。
5. 机械刺激增强成牙骨质细胞中 STAT3 的激活：同样通过 Western blot 检测发现，压缩力能诱导 OCCM - 30 细胞中 STAT3 显著激活，表现为其磷酸化形式增加，非磷酸化形式减少。白藜芦醇虽有下调 STAT3 激活的趋势，但对其基础表达水平和磷酸化 STAT3（pSTAT3）水平无显著影响。
6. OCCM - 30 细胞对压缩刺激的反应是 NF - κB p65 核转位：免疫荧光结果显示，在 3 小时的压缩刺激和 10 μM 白藜芦醇处理后，机械刺激能使 NF - κB p65 从细胞质显著转位到细胞核，而白藜芦醇在基础条件和压缩力施加后，对 NF - κB p65 的定位均无显著影响。

研究结论与讨论

本研究表明，白藜芦醇能抑制成牙骨质细胞中压力诱导的 ERK 和 AKT 通路的磷酸化，同时以剂量和时间依赖的方式促进细胞活力。这一发现为将白藜芦醇应用于牙周膜干细胞（PDLSC）和牙周组织，调节牙周组织对机械刺激的反应提供了理论基础，且不会对成牙骨质细胞产生负面影响。

在研究中，白藜芦醇的浓度选择参考了红酒中的天然含量以及人体血浆中的浓度范围。以往其他针对牙周细胞和白藜芦醇的研究使用的浓度高达 100 μM，而本研究选择 10 μM 的浓度，是因为该浓度在不表现出细胞毒性的同时，对蛋白和 mRNA 表达最为有效。白藜芦醇具有低毒性的特点，在大鼠实验中，高达 1000 mg/kg 体重的剂量下，急性和慢性毒性都较低；在人体短期研究中，高剂量（如每天 2.5 或 5 g）虽会引起一些轻微且不一致的副作用，如胃肠道不适，但目前尚无长期使用的相关数据。

研究还发现，成牙骨质细胞在受到机械刺激时，会出现 Il - 6 和 Cox2 mRNA 表达上调、STAT3 激活以及 NF - κB p65 核转位增加的现象，这些都表明成牙骨质细胞参与了牙周组织的重塑过程，最终促使牙齿移动。而白藜芦醇对这些过程的调节作用，为其在正畸治疗中的应用提供了潜在价值。尽管白藜芦醇在本研究中对成牙骨质细胞的某些炎症相关指标的调节效果不如预期，如对 Cox2 表达和 NF - κB p65 核转位的影响不显著，但这可能与研究使用的细胞类型和机械刺激模型不同有关。

值得注意的是，先前的研究表明白藜芦醇对人牙周膜成纤维细胞具有抗炎作用，能显著降低促炎细胞因子的表达。牙周膜成纤维细胞在牙齿移动和牙骨质形成中起着重要作用，参与牙周组织的多种生理过程。本研究中白藜芦醇对成牙骨质细胞活力无负面影响，这意味着它有望用于调节牙周膜干细胞的炎症反应，而不影响成牙骨质细胞的正常功能。

综上所述，这项研究为正畸治疗中利用白藜芦醇控制炎症反应、减少牙根吸收等副作用提供了新的方向，具有重要的理论和实践意义，为后续的临床研究和应用奠定了坚实基础。未来，还需要进一步深入研究白藜芦醇在体内的作用机制和长期效果，以更好地将其应用于正畸临床治疗，造福广大患者。