同时测定兽药制剂中抗球虫药物的稳定性指示高效液相色谱方法的建立和验证：绿度和白度评价

　　

新型 HPLC 方法测定兽用抗球虫药：多维度评估与应用前景

在现代家禽养殖产业中，肠道球虫病作为一种严重的寄生虫疾病，一直是制约产业发展的关键因素。埃及纳赫达大学（Nahda University）药学系药物化学部的 Michel Y. Fares 等人，在《Scientific Reports》期刊上发表了名为 “Development and validation of a stability-indicating HPLC method for the simultaneous determination of anticoccidial drugs in veterinary formulations: greenness and whiteness assessment” 的论文。这一研究成果对于家禽肠道球虫病的防控以及兽用药物分析领域意义重大，为保障家禽健康、减少产业经济损失提供了有力的技术支持，同时在绿色分析化学应用方面做出了积极探索。

研究背景

肠道球虫病严重影响家禽健康，它破坏家禽的营养吸收机制，致使家禽体重下降、死亡率上升。同时，感染带来的应激反应会削弱家禽免疫系统，使其更易遭受二次感染，进而降低整体生产效率。在药物治疗方面，长期使用单一抗球虫药导致耐药菌株不断出现，联合用药成为应对这一问题的重要策略。其中，氨丙啉（AMP）、磺胺喹恶啉（SUL）、地克珠利（DIV）和维生素 K3（VIT K3）的联合使用较为常见，但此前尚无针对这四种药物同时测定的分析技术，且对它们的稳定性研究也不全面。此外，绿色分析化学作为化学分析领域的发展趋势，强调在分析过程中减少对环境的影响，提高实验室安全性与效率，因此评估分析方法的生态友好性和可持续性至关重要。

研究材料与方法

实验仪器

研究使用 Agilent 1200 系列高效液相色谱仪（HPLC），配备自动进样器（G1367C）、四元泵（G1312A）、柱温调节器（G1316A）和紫外检测器（G1315B），确保实验数据的准确性和可靠性。

实验材料

实验所用的 AMP、SUL、VIT K3 和 DIV 标准品分别由杭州龙创生物科技有限公司、济南安克赛斯生物技术有限公司和南海北沙制药有限公司提供，纯度分别为 98.17%、99.2%、99.1% 和 98.39%。实验用兽药 Treatcox? 由阿拉伯明胶和药品公司生产，其粉末制剂中每 100 克含有 20 克 AMP、20 克 SUL、2.0 克 VIT K3 和 2.1 克 DIV。实验使用的乙腈（HPLC 级）购自 Sigma Aldrich 公司，磷酸二氢钾购自 Merck 公司。

色谱条件

采用 Supelcosil-C18 柱（4.6-mm×25-cm，5 μ）进行分离，以 0.05 M 和乙腈按 80:20（v/v）混合作为流动相，流速设定为。在室温下，每次进样 10 μL，于 260 nm 波长处进行紫外检测。

标准溶液制备

精确称取一定量的 AMP、VIT K3、DIV 和 SUL，溶解于 90% 乙腈水溶液中，定容至 25 mL，配制成储备标准溶液。再取适量储备液，用相同稀释剂在 100 mL 容量瓶中稀释，分别配制成浓度为 AMP、 VIT K3、 DIV 和 SUL 的工作标准溶液。

线性范围与校准曲线

对工作标准溶液进行系列稀释，使 AMP 和 SUL 浓度在，VIT K3 浓度在，DIV 浓度在范围内。每个浓度点进样三次，以峰面积为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制校准曲线，计算回归方程。

稳定性研究

按照 ICH 指南，在不同酸性、碱性、氧化、光照和热条件下进行稳定性研究。例如，酸水解实验中，将标准品加入 1 N HCl 溶液，在 80°C 水浴加热 1 小时，用 1 N NaOH 调节 pH 至 7.0，再稀释测定；碱水解则将 HCl 与 NaOH 互换；氧化水解使用 0.5% 处理标准品；光降解实验将标准溶液分别暴露于阳光 48 小时和紫外辐射 12 小时；热降解实验在 80°C 水浴加热药物溶液 8 小时，冷却过滤后测定。

药物制剂含量测定

称取 1 克 Treatcox? 粉末，溶解于 70 mL 稀释剂中，超声 5 分钟，定容至 100 mL。取 1 mL 该溶液转移至 50 mL 容量瓶中，稀释、过滤后测定其中 AMP、VIT K3、DIV 和 SUL 的浓度。

研究结果

方法开发与优化

通过对多种流动相组合、分析柱和检测波长的试验，确定了最佳色谱条件。使用乙腈作为有机相，磷酸二氢钾作为水相时，峰形、分离度和保留时间得到显著改善；Supelcosil-C18 柱的分离效果优于 Kinetex-C18 柱；260 nm 为最佳检测波长。在该条件下，四种药物及其降解产物能实现良好分离，AMP、VIT K3、DIV 和 SUL 的保留时间分别为 1.309 ± 0.011 min、2.084 ± 0.008 min、3.577 ± 0.021 min 和 7.816 ± 0.056 min，系统适用性参数良好。

降解行为研究

研究发现，AMP 在酸性和碱性水解条件下相对稳定，但在光降解、氧化和热降解过程中会发生不同程度的降解，其中氧化和热降解时降解率较高，分别达到 34.06 - 38.92%。VIT K3 在碱性水解时降解率约为 8%，在其他降解条件下为 12.78 - 17.11%。DIV 不受光降解影响，但在酸性、碱性和热降解时会有一定程度的降解，氧化条件下降解最为明显，降解率达 33.36%。SUL 对热降解、酸性水解和光解具有稳定性，在碱性水解和氧化降解时降解率约为 19%。实验表明，该方法能够有效区分药物及其降解产物，是一种稳定性指示方法。

方法验证

依据 ICH 指南对方法进行全面验证。线性关系良好，AMP、VIT K3、DIV 和 SUL 在各自浓度范围内的相关系数（r）均大于 0.999。准确性方面，不同浓度水平的回收率在 98.30 - 101.77% 之间。精密度通过计算相对标准偏差（RSD%）评估，RSD 不超过 2%，表明方法重复性和再现性良好。低的定量限（LOQ）和检测限（LOD）确保了方法的高灵敏度。特异性实验显示，该方法对目标药物具有良好的选择性，不受辅料和降解产物干扰。在不同环境条件下进行的耐用性和稳健性实验，结果表明方法受影响较小，具有良好的耐用性和稳健性。

兽用制剂中的应用

将该方法应用于 Treatcox? WSP 粉末中四种药物的测定，结果显示无辅料干扰，四种药物峰形良好，在预期保留时间出峰，回收率分别为 AMP 102.45%、VIT K3 100.06%、DIV 100.95% 和 SUL 101.70%，表明该方法适用于兽用制剂中目标药物的测定。

与其他方法比较

文献调研发现，此前针对 AMP、VIT K3、DIV 和 SUL 四种药物同时测定的方法尚未见报道，已有的方法大多针对其中两种或三种药物。与其他方法相比，本研究开发的方法具有分析时间短的优势，更具应用价值。

绿色度、蓝色度和白色度综合评估

运用多种评估工具对方法的生态友好性进行评估。绿色分析程序指数（GAPI）评估显示，该方法对环境风险较低，具有一定绿色度。蓝色适用性等级指数（BAGI）评分达 80，表明其实践应用良好、生产效率高、自动化潜力大且运行成本低。白色度评估中，该方法在红色、绿色和蓝色得分分别为 87.5%、87.5% 和 90.8%，总白色度得分 88.6%，质量和绿色度较为理想。此外，AGREE 得分 0.64，分析生态规模（Eco-scale）得分 86，在与其他方法的比较中，本方法在绿色度方面表现出色。

研究结论与讨论

本研究成功开发并验证了一种新型、灵敏且环境友好的 HPLC 方法，能够同时测定兽用制剂中的 AMP、SUL、DIV 和 VIT K3 及其降解产物。通过全面的稳定性研究，明确了四种药物在不同条件下的降解行为，为药物制剂的稳定性评估提供了重要依据。方法验证结果表明，该方法符合 ICH 指南要求，具有良好的线性、准确性、精密度、灵敏度、特异性、耐用性和稳健性，适用于兽用制剂中目标药物的常规分析。与其他已报道方法相比，本方法不仅首次实现了四种药物的同时测定，而且分析时间更短，具有显著优势。在绿色分析化学方面，通过多种评估工具的综合评价，证实该方法对环境影响小，具有良好的可持续性。

然而，本研究也存在一定局限性，如无法确定降解产物的结构。未来研究可结合 NMR 和 MS 技术，进一步明确降解产物结构，完善药物稳定性研究。总体而言，该研究成果在兽用抗球虫药分析领域具有重要的应用价值，有望推动家禽养殖产业中肠道球虫病防控技术的发展，提高家禽健康水平，减少经济损失，同时为绿色分析化学在兽用药物分析中的应用提供了有益参考，促进了该领域的可持续发展。