ZCCHC4通过ROS/c-myc轴调控食管癌进展和顺铂耐药

　　

锌指蛋白 ZCCHC4 调控食管癌进展及顺铂耐药机制研究解读

近期，来自北川医学院附属医院临床检验部以及南昌大学第二附属医院临床检验部等单位的研究人员，在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “ZCCHC4 regulates esophageal cancer progression and cisplatin resistance through ROS/c-myc axis” 的研究论文。该研究聚焦于锌指 CCHC 型含 4 蛋白（ZCCHC4）在食管癌中的作用机制，为食管癌的诊断和治疗开辟了新的思路，对深入理解食管癌的发病机制及开发更有效的治疗策略具有重要意义。

一、研究背景

食管癌是全球范围内癌症相关死亡的第六大主要原因，具有早期难以诊断、易转移的特点。食管鳞状细胞癌（ESCC）是食管癌的主要组织学亚型，在中国新诊断病例中约占 90%。早期 ESCC 预后相对较好，而晚期疾病预后较差，因此探索食管癌发生发展的机制对其诊断和治疗至关重要。

ZCCHC4 是一种新发现的 N6 - 甲基腺苷（）RNA 甲基转移酶，同时具有 RNA 结合蛋白（RBP）锌指结构域。已有研究表明，ZCCHC4 在多种肿瘤中表达异常，与肿瘤预后不良和化疗耐药相关，如肝癌、肺癌和结直肠癌等。然而，其在食管癌中的表达和功能尚未明确。深入研究 ZCCHC4 在食管癌中的作用，有望为食管癌的诊疗提供新的生物标志物和治疗靶点。

二、研究材料与方法

1. 数据处理与表达分析：利用 TIMER 2.0 数据库和人类蛋白质图谱分别分析 ZCCHC4 在泛癌中的 mRNA 和蛋白质表达情况。
2. 样本采集：收集 ESCC 患者手术切除的癌组织和癌旁正常组织样本，迅速置于 RNAlater 溶液中，并保存于 - 80°C。研究经南昌大学第二附属医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。
3. RNA 提取与定量实时 PCR：使用 TRIzol 试剂提取组织和外周血单个核细胞（PBMCs）的总 RNA，通过特定引物进行定量实时 PCR，检测 ZCCHC4、c - myc 和 β - actin 等基因的表达水平。
4. 蛋白质印迹分析（WB）：用于检测组织和细胞中 ZCCHC4、c - myc、p - H2A.X 和 β - actin 等蛋白的表达水平，所用一抗购自 Cell Signaling Technology 公司。
5. 功能和通路富集分析：运用 “基因集变异分析”（GSVA）软件包研究 ZCCHC4 与食管癌标志性基因集的相关性。
6. 细胞培养与转染：培养 ESCA 细胞系（KYSE150、ECA10），在含 1% 青霉素 / 链霉素和 10% 胎牛血清的 RPMI - 1640 培养基中，于 37°C、5% 条件下培养。使用 GenePharm 公司设计合成的 shRNA 转染细胞以敲低 ZCCHC4 表达，通过表达质粒转染实现 ZCCHC4 过表达，并用嘌呤霉素筛选稳定细胞系，通过 qRTPCR 和 WB 评估转染效率。
7. 细胞增殖和流式细胞术检测：采用 CCK - 8 法检测细胞活力，流式细胞术分析细胞周期、凋亡以及细胞内活性氧（ROS）水平。
8. 动物实验：选用约 4 周龄的 BALB/c 裸鼠，经皮下注射稳定转染的 KYSE150 细胞构建荷瘤小鼠模型。测量肿瘤体积和重量，部分小鼠腹腔注射顺铂进行治疗，实验遵循南昌大学实验动物中心的相关规定和 ARRIVE 指南。
9. 统计分析：运用 R 软件（4.2.1）及相关 R 包进行统计分析，采用 Wilcoxon 秩和检验比较两组差异，Spearman 相关分析计算相关系数，GraphPad Prism 9.0 软件辅助数据分析，以span data-custom-copy-text="\(p 0.05\)"为差异具有统计学意义。

三、研究技术路线

首先，研究人员通过数据库分析和临床样本检测，探究 ZCCHC4 在食管癌中的表达情况及其与临床病理特征的关系。接着，在细胞水平上，利用转染技术改变 ZCCHC4 的表达，通过多种实验方法检测细胞增殖、凋亡、细胞周期、ROS 水平以及相关蛋白和基因的表达变化，初步探索 ZCCHC4 的功能及潜在机制。然后，在动物水平构建荷瘤小鼠模型，验证 ZCCHC4 对食管癌生长和对顺铂耐药性的影响。最后，综合各项实验结果，深入分析 ZCCHC4 在食管癌发生发展及顺铂耐药中的作用机制。

四、研究结果

4.1 ZCCHC4 表达与食管癌患者临床病理特征的关系

利用 TIMER 数据库分析发现，食管癌患者中 ZCCHC4 mRNA 表达显著上调。通过 qRT - PCR 检测 ESCC 肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织中 ZCCHC4 mRNA 水平，证实肿瘤组织中表达更高，且与 TCGA 数据库结果一致。在 41 对 ESCC 组织中检测蛋白水平，30 例肿瘤组织呈现明显过表达。进一步分析发现，ZCCHC4 mRNA 高表达与淋巴结转移状态（N0、N2、N3、N4）、癌症分期（1 - 4 期）和肿瘤组织学显著相关，且其表达与 TNM 分期和淋巴结转移有关。由此表明，ZCCHC4 在食管癌中异常表达，且其 mRNA 表达与临床病理特征密切相关。

4.2 ZCCHC4 水平与食管癌患者肿瘤标志物的相关性

分析 ZCCHC4 表达水平与食管癌肿瘤标志物（CEA、SCC、TPA、CYFRA21 - 1）的相关性，发现 ZCCHC4 mRNA 表达与 CEA、SCC、TPA 显著相关，但与 CYFRA21 - 1 无明显关联。同时，高表达 ZCCHC4 的患者总体生存率（OS）较低。这说明 ZCCHC4 有望成为辅助食管癌诊断和评估预后的生物标志物。

4.3 ZCCHC4 与 c - myc 靶通路的相关性

运用 GSVA 软件包分析显示，ZCCHC4 与食管癌中细胞增殖相关通路密切相关，其中 c - myc 靶通路富集最为显著。检测食管癌组织中致癌基因 c - myc 的表达，发现其较癌旁非肿瘤组织明显上调，且 c - myc mRNA 表达与 ZCCHC4 水平呈正相关，进一步验证了两者在功能上的联系。

4.4 下调 ZCCHC4 抑制食管癌细胞增殖、促进凋亡并增加顺铂敏感性

利用 shRNA 敲低 ZCCHC4 表达后，发现 c - myc 表达下降，DNA 损伤标记物 p - H2A.X 显著增加。流式细胞术分析表明，敲低 ZCCHC4 后食管癌细胞内 ROS 生成增多，细胞活力显著抑制，对顺铂的敏感性增加，细胞周期阻滞在 G2 期，S 期减少，凋亡明显增加。这表明下调 ZCCHC4 可能通过产生 ROS 抑制食管癌细胞增殖。

4.5 清除 ROS 可挽救 ZCCHC4 敲低的食管癌细胞的增殖并减少凋亡

使用 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）清除 ROS 后，发现敲低 ZCCHC4 引起的 c - myc 表达下调和 p - H2A.X 表达增加得到部分逆转，细胞活力得到恢复，细胞周期 S 期增加，凋亡减少。说明清除 ROS 能够逆转 ZCCHC4 敲低对 ESCC 细胞增殖和凋亡的影响。

4.6 过表达 ZCCHC4 促进食管癌细胞增殖、抑制凋亡并增加顺铂耐药性

在 ZCCHC4 过表达细胞系中，c - myc 表达增加，p - H2A.X 减少，ROS 水平降低。细胞增殖能力增强，对顺铂的耐药性增加，细胞周期中 G0/G1 期减少，S 期增加，凋亡减少。表明 ZCCHC4 过表达促进食管癌细胞增殖、抑制凋亡并增加顺铂耐药性。

4.7 敲低 ZCCHC4 抑制食管癌体内进展并降低顺铂耐药性

构建荷瘤小鼠模型，发现敲低 ZCCHC4 组的皮下肿瘤最终体积、重量均显著小于对照组，肿瘤生长明显受到抑制。经顺铂治疗后，敲低 ZCCHC4 组的肿瘤体积和重量进一步减小。证实敲低 ZCCHC4 在体内能够抑制食管癌进展并降低顺铂耐药性。

五、研究结论

本研究表明，ZCCHC4 在食管癌组织中异常高表达，其 mRNA 水平与临床病理特征显著相关，提示 ZCCHC4 在食管癌的诊断和预后评估中具有潜在辅助作用。下调 ZCCHC4 可通过 ROS/c - myc 轴增加 ESCC 细胞对顺铂的敏感性，抑制食管癌细胞增殖并促进其凋亡。然而，研究存在一定局限性，尚未明确 ZCCHC4 与 c - myc 的直接结合机制，具体作用机制仍需进一步深入研究。

六、研究讨论

食管癌目前的治疗手段主要包括手术、化疗、放疗和分子靶向治疗，但患者预后仍不理想，急需寻找新的早期诊断生物标志物和治疗靶点。本研究首次报道了 ZCCHC4 在食管癌中的作用，发现其在食管癌中异常高表达，且与 TNM 分期、淋巴结转移以及患者 OS 相关，表明其在食管癌诊疗中具有潜在价值，但作为诊断生物标志物的敏感性、特异性以及检测方法的便利性等方面还需进一步研究。

在机制方面，ZCCHC4 与 c - myc 靶通路密切相关，敲低 ZCCHC4 可诱导 DNA 损伤，促使 ROS 积累，进而下调 c - myc 表达，影响食管癌细胞的增殖、凋亡以及对顺铂的敏感性。这揭示了 ZCCHC4 在调节 ROS 稳态和 c - myc 介导的信号通路中的关键作用，为食管癌的治疗提供了新的潜在靶点。后续进一步研发针对 ZCCHC4 的特异性抑制剂，有望为食管癌的治疗带来新的突破，改善患者的预后。