TIGIT在肝外胆管癌中的表达及其对CD8 + T细胞耗竭的影响：免疫治疗的意义

　　

靶向 TIGIT：肝外胆管癌免疫治疗新希望 —— 解读《TIGIT expression in extrahepatic cholangiocarcinoma and its impact on CD8 + T cell exhaustion: implications for immunotherapy》

陆军军医大学第一附属医院肝胆外科的 Tengqian Tang 等研究人员，在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为《TIGIT expression in extrahepatic cholangiocarcinoma and its impact on CD8 + T cell exhaustion: implications for immunotherapy》的论文。这篇论文在肝外胆管癌（Extrahepatic cholangiocarcinoma，ECCA）免疫治疗领域意义非凡，为探寻更有效的治疗策略提供了关键线索。

论文摘要指出，研究人员通过单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）分析 ECCA 肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），发现 TIGIT（T 细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域蛋白）在 TOX + CD8 T 细胞中显著高表达。组织微阵列和免疫组化染色显示，TIGIT 高表达与患者生存率降低相关。进一步研究表明，TIGIT + CD8 + T 细胞表现出多种免疫抑制特征，且在患者来源的异种移植（PDX）模型中，抗 TIGIT 治疗展现出积极疗效，这意味着靶向 TIGIT 有望成为增强 CD8 + T 细胞反应、改善 ECCA 治疗效果的有效途径。

在癌症治疗领域，免疫疗法近年来备受瞩目，它利用人体自身免疫系统对抗癌细胞，为攻克癌症带来了新的希望。然而，T 细胞耗竭（Tex）却成为免疫治疗路上的 “绊脚石”。TOX 作为耗竭 T 细胞中重要的转录因子，而 TCF - 1 则对维持 CD8 T 细胞活性意义重大，尤其在面对持续的病毒或肿瘤抗原时，它就像一位 “守护者”，守护着 T 细胞的战斗力。免疫检查点阻断疗法，如针对 PD - 1、Lag - 3、Tim - 3 等靶点的治疗，已展现出一定潜力，能重新激活肿瘤浸润细胞功能，提升免疫治疗效果。

TIGIT 作为一种免疫检查点蛋白，在 T 细胞和 NK 细胞上均有表达。它就像免疫系统中的 “刹车”，与靶细胞或抗原呈递细胞上的 CD155 结合后，会抑制免疫反应，还与多种癌症的肿瘤生长有关。但截至目前，在 ECCA 治疗中，针对 TIGIT 的研究还是一片空白。

ECCA 是一种恶性肿瘤，属于胆道癌（BTC）的一种亚型。近年来，BTC 的发病率呈上升趋势，而 ECCA 早期症状隐匿，多数患者确诊时已处于晚期，常伴有浸润和转移。由于其病变位置隐蔽，手术切除难度大，根治性切除成功率低。即使接受根治性切除，患者 5 年生存率也仅约 16.5% ，对于无法切除的患者，生存率更是低于 10%，预后情况不容乐观。因此，寻找新的治疗靶点和策略迫在眉睫。基于此，本研究收集了 302 例人类 ECCA 组织样本，旨在探究 TIGIT 在 ECCA 中的表达及其对 CD8 + Tex 的影响，并评估 TIGIT 抗体作为免疫治疗药物的潜在疗效，为 ECCA 患者带来新的希望。

研究人员从陆军军医大学第一附属医院肝胆外科 2010 - 2021 年收治的患者中获取了 302 例人 ECCA 组织样本，并获得了患者的知情同意，研究也得到了伦理委员会的批准。

研究人员利用武汉赛维尔生物科技有限公司构建的组织微阵列（TMA），对 89 例 ECCA 样本进行免疫组化（IHC）分析，检测 TIGIT 蛋白的表达。实验过程中，先对切片进行脱蜡、水化处理，用 阻断内源性过氧化物酶活性，在 EDTA 缓冲液中进行抗原修复，然后与抗 TIGIT 一抗孵育，再与二抗反应，最后用苏木精染色并封片分析。

对福尔马林固定、石蜡包埋的人 ECCA 组织进行免疫组化处理。同样先阻断内源性过氧化物酶，用山羊血清封闭以防止非特异性结合，加入抗 CD3 和抗 TIGIT 一抗孵育，次日与 HRP 标记的二抗反应，最后进行 DAB 染色。

将组织切片固定、通透化、抗原修复后，用牛血清白蛋白（BSA）封闭，与抗 CD8 和抗 TIGIT 抗体孵育过夜，洗涤后加入荧光二抗，用 DAPI 染核，封片后进行荧光成像。

用胶原酶将人和小鼠的 ECCA 组织解离成单细胞悬液，用针对 CD8、PD - 1、IFN - α、TNF - γ、颗粒酶 B（GRZB）和 TCF - 1 的抗体（Biolegend 公司）标记细胞，通过流式细胞术分析免疫标记物。

采用 Kaplan - Meier 曲线和对数秩检验对 289 例 ECCA 患者样本（排除 13 例失访病例）进行生存分析，运用 Cox 比例风险模型评估 TIGIT 表达水平（低表达与高表达）的意义。

利用 ECCA 患者的肿瘤组织，将其皮下植入 SCID 小鼠体内建立 PDX 模型。定期监测肿瘤生长情况，设置治疗组分别给予 PBS 或抗 TIGIT 治疗。当肿瘤负担或体重减轻超过预定限度时，对小鼠实施安乐死。随机选取每组 6 只小鼠进行后续的流式细胞术分析，整个实验过程进行了盲法处理，并且动物实验获得了陆军军医大学动物伦理与实验委员会的批准。

裂解小鼠组织样本，用 BCA 法测定蛋白质浓度，进行 SDS - PAGE 电泳后转膜、封闭，与 TCF - 1、TOX1、NR4A1、PTPN2、GAPDH 等一抗孵育，最后用 Odyssey 成像仪扫描。

使用肿瘤解离试剂盒消化 ECCA 组织，分离出肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。利用 10x Genomics 平台制备单细胞 RNA 文库，在 Illumina HiSeq X Ten 上进行 150 - bp 双端测序，序列数据在补充信息中提供。

使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析。组间比较采用方差分析（ANOVA），生存曲线通过 Kaplan - Meier 分析和对数秩检验评估，span data-custom-copy-text="\(p 0.05\)" 被认为具有统计学意义。

研究共纳入 302 例 ECCA 患者，其中男性 116 例（38.5%），女性 186 例（61.5%），中位年龄 61 岁。多数患者（252 例，83.4%）为肝门部胆管癌，50 例（16.6%）为远端胆管癌。大部分患者（280 例，92.8%）接受了手术治疗，不同手术方式分布各异。肿瘤分化程度方面，高分化 40 例（13.3%），中分化 189 例（62.6%），低分化 73 例（24.1%）。肝门部胆管癌患者根据 Bismuth - Corlette 分类，各型病例数也有所不同。此外，研究还记录了患者的胆红素、白蛋白、CA19 - 9 水平以及胆道引流情况等信息，肝门部胆管癌患者无病生存期为 12 个月，总生存期为 20 个月。

研究人员运用 scRNA - seq 技术研究 ECCA 的 TIL 细胞，经过一系列筛选，保留了 13000 个合格细胞进行后续分析。通过对细胞的注释发现，T 细胞是 TILs 中数量最多的细胞亚群，占比高达 72.02%，这表明 T 细胞在 ECCA 肿瘤环境中可能发挥着至关重要的作用。

根据 T 细胞相关标记物对 T 细胞亚群进行注释，进一步聚类分析发现，CD4 T 细胞可细分为 6 个簇，CD8T 细胞可细分为 5 个簇，TOX 主要在 CD8 簇 1 - 5 中表达。转录组分析显示，TOX + CD8 亚组中 ZEB2（CD247，SAMSN1）高表达，且 TIGIT 在 TOX + CD8 T 细胞中显著高表达，这提示 TIGIT 高表达可能与 T 细胞耗竭有关。

对 89 例 ECC 患者随机选取的样本进行组织微阵列分析，结果显示样本中存在 TIGIT 阳性表达。免疫组化染色和双免疫荧光染色进一步证实了 TIGIT 与 CD8 在细胞表面的共定位。生存分析表明，TIGIT 低表达的 ECCA 患者生存率明显更高，其与 CD155 主要在上皮细胞表达的结果共同提示，TIGIT 可能在 ECCA 患者免疫反应中发挥调节作用，高表达与不良预后相关。

流式细胞术分析发现，TIGIT + CD8 T 细胞中程序性死亡 1（PD - 1）和 T 细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域 - 3（TIM - 3）表达显著高于 TIGIT - CD8 T 细胞，而肿瘤坏死因子（TNF - α）和干扰素 - γ（IFN - γ）表达则降低。这表明 TIGIT 可能与其他免疫检查点分子协同作用，诱导 CD8 T 细胞耗竭，助力肿瘤免疫逃逸。

研究发现，与 TIGIT - CD8 + T 细胞相比，TIGIT + CD8 + T 细胞中 TCF - 1 + T 细胞比例降低，且 TIGIT 表达与 TCF - 1 表达呈负相关，这进一步表明 TIGIT 对 ECCA 中 T 细胞耗竭有潜在影响。

在 PDX 模型中，给予抗 TIGIT 治疗后，小鼠肿瘤生长明显减缓，肿瘤重量显著降低，肿瘤组织中效应 CD8 + T 细胞增多，CD44 + CD8 + T 细胞亚群中 IFN - γ + 和 GRZB + 细胞比例增加，虽然 IFN - γ + 细胞比例增加无统计学意义，但 GRZB + 细胞比例增加显著。Western blotting 分析显示，抗 TIGIT 治疗组中 T 细胞耗竭抑制因子 TCF - 1 蛋白表达升高，而促进 T 细胞耗竭的 TOX1 和 NR4A1 蛋白表达降低。这一系列结果表明，TIGIT 抗体治疗可能通过对抗 T 细胞耗竭，增强 CD8 + T 细胞免疫能力和细胞毒性，抑制 ECC 生长。

研究人员通过单细胞 RNA 测序等一系列实验，深入探究了 TIGIT 在 ECCA 中的作用机制及靶向 TIGIT 的治疗潜力。研究发现，T 细胞是 ECCA 肿瘤浸润淋巴细胞中最丰富的细胞亚群，TIGIT 在 TOX + CD8 T 细胞中显著高表达，且高表达的 TIGIT 与 ECCA 患者生存率降低密切相关。TIGIT + CD8 T 细胞呈现出耗竭状态，具有低潜在杀伤能力，同时 TIGIT 还可能通过影响 NF - κB、PI3K 和 MAPK 等信号通路，参与 T 细胞耗竭的调控过程。

在功能上，TIGIT + CD8 + T 细胞表现出多种 T 细胞耗竭的特征，比如 PD - 1 和 TIM - 3 表达升高，TNF - α 和 IFN - γ 产生减少。此外，TIGIT + CD8 + T 细胞中 TCF - 1 转录因子表达降低，这意味着 TIGIT 可能对 T 细胞的干性和功能产生重要影响。

更为重要的是，在 ECCA 患者来源的异种移植模型中，靶向 TIGIT 的抗体治疗展现出显著的效果。它不仅能够抑制肿瘤生长，还能增加效应 CD8 + T 细胞的浸润，提高 GRZB 的产生，有效对抗 T 细胞耗竭，增强 CD8 + T 细胞的抗肿瘤活性。这一发现为 ECCA 的免疫治疗开辟了新的方向。

总的来说，这项研究首次深入剖析了 TIGIT 在 ECCA 发生发展和免疫逃逸中的关键作用，明确了 TIGIT 作为潜在治疗靶点的重要意义。靶向 TIGIT 的抗体疗法为 ECCA 患者带来了新的希望，有望成为一种有效的免疫治疗策略。然而，目前该研究仍处于初步阶段，要想将 TIGIT 抗体治疗真正应用于临床，还需要开展更多深入的研究和大规模的临床试验，进一步探究其详细的作用机制，全面评估其安全性和疗效，为 ECCA 患者提供更安全、更有效的治疗方案。