在微流控装置中使用碳丝网印刷电极进行快速抗菌药敏试验

　　

新型微流控装置：快速抗菌药敏测试的突破

印度理工学院马德拉斯分校（Indian Institute of Technology Madras）的研究人员 Saranya Gopalakrishnan、Diksha Mall、Subramaniam Pushpavanam 和 Richa Karmakar 在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Rapid antimicrobial susceptibility testing using carbon screen printed electrodes in a microfluidic device” 的论文。该研究开发出一种利用微流控装置中碳丝网印刷电极进行快速抗菌药敏测试（AST）的新方法，这一成果对控制抗生素滥用、应对日益严峻的抗菌耐药性威胁意义重大，为全球公共卫生领域提供了极具价值的技术支持 。

一、研究背景

抗菌耐药性（AMR）已被世界卫生组织（WHO）列为全球健康的十大威胁之一。据估计，2019 年全球有 495 万人的死亡与细菌 AMR 有关，资源有限地区的发病率最高。抗菌药敏测试（AST）能确定针对特定感染的可用药物的耐药性和敏感性，对控制抗生素的不合理使用、减轻 AMR 负担至关重要。

传统的基于培养的 AST 方法劳动强度大、周转时间长（48 - 72 小时），难以满足临床快速检测的需求。基于聚合酶链反应原理的基因分型方法虽然能快速产生高通量结果，但存在需要精密仪器、持续更新耐药谱以及需通过表型测试确认结果等问题。其他如显微镜、光谱法、质谱法和原子力显微镜等技术，成本高昂且对技术人员要求高，在资源受限地区难以推广应用。

电化学阻抗谱是一种快速、稳健且无标记的细菌检测和 AST 诊断工具。虽然已有研究利用叉指电极（IDEs）或金丝网印刷电极进行细菌检测和 AST，但存在设备制造复杂、成本高的问题。将电化学检测整合到微流控系统中备受关注，能使用少量样本加快检测速度，但现有技术在检测灵敏度、成本和设备通用性等方面仍有待提升。

二、研究材料和方法

（一）材料

实验选用革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 25922）和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC 6051）。使用的培养基有胰蛋白胨营养培养基（TNM）和 LB 肉汤，抗生素为氨苄青霉素和四环素，电极材料为碳石墨烯糊，微流控装置材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS）。

（二）方法

1. 制备细菌培养物和抗生素：将细菌在 TNM 中过夜培养，离心后用 10% TNM 重悬，通过紫外可见分光光度计测量光密度确定细菌浓度，并制备不同浓度梯度的细菌悬液。氨苄青霉素和四环素的储备液溶解在无菌去离子水中，实验时现配工作浓度。
2. 选择电解质：研究不同浓度（10%、25%、50%、75%、100%）的 TNM 和 LB 对阻抗信号及细菌生长的影响，以筛选出能提供高阻抗基线信号且支持细菌生长的电解质，最终确定 10% TNM 为最佳电解质。
3. 电化学阻抗谱（EIS）测量：使用便携式电位计在 1 MHz 至 50 Hz 的正弦频率和 50 mV（AC）电压下测量工作电极和对电极之间的阻抗，所得数据用改进的兰德尔等效电路模型拟合。
4. 细菌生长实验：通过分批实验研究不同浓度 TNM 对细菌生长的影响，测量不同时间点的光密度，绘制生长曲线，计算生长速率和倍增时间。同时研究不同浓度细菌对 10% TNM 阻抗信号的影响。
5. 制作丝网印刷电极和微流控装置：采用丝网印刷技术在玻璃基板上制作碳电极，用 3D 打印技术制作 PDMS 微流控装置，将两者组装后进行细菌检测和药敏测试。
6. 细菌检测：将功能化微流控装置加载细菌悬液，孵育使细菌固定，冲洗后测量不同孵育时间的阻抗谱，通过归一化阻抗信号（NIS）反映细菌浓度。
7. 抗菌药敏测试（AST）：设置阳性对照（PC）和 AST 装置，在 AST 装置中加入抗生素，对比两者的 NIS 确定细菌的药敏特性，并通过细菌活力测定和标准纸片扩散试验进行验证。
8. 尿液样本实验：收集医院患者的尿液样本，分别进行无细菌样本、加菌样本和加菌且加抗生素样本的实验，验证装置在复杂尿液样本中的检测能力。
9. 统计分析：所有实验至少重复三次，使用 GraphPad Prism 6.01 软件进行非配对学生 t 检验，以 95% 置信区间比较两组独立数据。

三、研究结果

（一）优化电解质

通过研究不同浓度 TNM 和 LB 对阻抗信号和细菌生长的影响，发现 10% TNM 的阻抗值比 10% LB 高约 3 倍，且虽其支持细菌生长的能力较 100% TNM 弱，但仍能满足高浓度细菌（~10? CFU/mL）的生长需求，适合作为电解质。使用改进的兰德尔电路模型拟合 10% TNM 的实验数据，能很好地反映其阻抗特性。随着细菌浓度增加，电解质（10% TNM）的阻抗值降低，这是因为高浓度细菌细胞促进了工作电极和对电极之间的电子转移。

（二）电化学微流控装置（ε-μD）设计和细菌检测

设计的 ε-μD 采用低成本碳电极，优化后的尺寸为 1.5 mm（宽）×14 mm（长）×0.5 mm（深），电极宽度 0.5 mm。通过荧光显微镜观察不同初始浓度细菌在装置上的固定数量，发现初始浓度为 10? CFU/mL 时，固定细菌数量为 84 ± 6 个 /mm2 。随着细菌生长，ε-μD 的阻抗值发生显著变化，Nyquist 图中肘点向左移动，电荷转移电阻降低。NIS 随初始细菌浓度增加而增加，在孵育 3 小时时，即使细菌密度低至 84/mm2（初始浓度 10? CFU/mL），NIS 值仍达 0.067 + 0.008，显著高于空白实验，证明装置灵敏度高。计算得到检测限为 525 CFU（对应初始细菌浓度 2×10? CFU/mL）。

（三）使用 ε-μD 进行抗菌药敏测试

以大肠杆菌对氨苄青霉素的药敏实验为例，敏感菌株在氨苄青霉素作用下，孵育后 Nyquist 图中肘点（反映电荷转移电阻 Rct）保持不变，而耐药菌株的肘点向左移动，表明细菌仍在生长，即对氨苄青霉素耐药。通过测量不同浓度氨苄青霉素作用下敏感和耐药菌株的 NIS，发现敏感菌株在 10 和 20 μg/mL 氨苄青霉素时 NIS 值显著低于 PC，耐药菌株在 50 μg/mL 时 NIS 与 PC 无显著差异，100 μg/mL 时才出现低阻抗变化，与 CLSI 标准相符。实验还验证了 ε-μD 对四环素和枯草芽孢杆菌的药敏测试能力，结果表明该装置对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及不同作用机制的抗生素均适用。

（四）使用人类尿液样本进行验证

在尿液样本实验中，无细菌的空白尿液样本 NIS 值可忽略不计，加菌的阳性尿液样本 NIS 值显著高于阴性样本，加菌且加四环素处理的样本 NIS 值最低，证明 ε-μD 能在复杂尿液样本基质中准确检测细菌并进行药敏测试。

（五）与现有文献比较

与现有文献相比，该研究开发的装置检测灵敏度高，能检测低至～84 cells/mm2 （相当于～1000 CFU，样本体积仅 10 μL）的固定细菌，检测限为 525 个固定细菌，可满足尿路感染诊断阈值要求，且能直接使用原始尿液样本。装置设计紧凑，采用低成本碳电极，更具成本效益和可及性，在快速、资源高效的诊断方面优势明显。

四、研究结论和讨论

研究人员成功开发出一种集成低成本碳电极的微流控芯片装置，用于快速细菌检测和药敏测试。选用 10% TNM 作为电解质，基于电荷转移电阻变化的 NIS 作为响应信号，能在 3 小时孵育时间内将 NIS 与细菌浓度、药敏 / 耐药特性相关联。该方法适用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及不同作用机制的抗生素，在人类尿液样本测试中也表现出良好的效果。

该装置成本低、灵敏度高、使用方便，有望在农村等资源受限地区广泛应用，推动药敏测试的普及，有效对抗抗菌耐药性。未来，将声学或惯性微流控、离心等预浓缩技术集成到现有装置中，可进一步提高检测灵敏度，拓宽临床应用范围，改善实际诊断效果，为全球抗菌耐药性监测和控制提供有力支持。