TTBK2 调控原发性纤毛形成的新机制：解锁 KIF2A 的关键作用

为探究 TTBK2 在纤毛生长和维持中的作用，研究人员通过研究疾病相关的 TTBK2 截断体，发现 TTBK2 通过调节 KIF2A 控制纤毛伸长和维持，且 TTBK2 在中心粒的富集在特定条件下可被绕过，这为理解纤毛相关疾病机制提供新视角。

　　在微观的细胞世界里，原发性纤毛（Primary cilia）就像细胞表面的 “触角”，承担着接收细胞外刺激的重要任务，对多细胞生物的复杂生命活动起着关键作用。它参与细胞信号传导，在发育、体内平衡维持以及疾病发生发展过程中都扮演着不可或缺的角色。一旦原发性纤毛出现功能障碍，就可能引发一系列被称为纤毛病（Ciliopathies）的人类疾病。

Tau - 微管蛋白激酶 2（TTBK2）作为原发性纤毛组装过程中的关键调节因子，其重要性不言而喻。它属于 CK1 超家族的丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在启动纤毛发生（Ciliogenesis）时，会通过与 CEP164 相互作用被招募到母中心粒（Mother centriole，MC）远端附件，进而调控纤毛形成的关键步骤，如招募高尔基体来源的前纤毛小泡和 IFT 蛋白，以及去除 CP110/CEP97 等。然而，目前关于 TTBK2 调控机制的全貌以及它与纤毛发生的详细关系仍未完全明晰。例如，虽然已知 TTBK2 能磷酸化许多与 MC 相关或细胞信号传导相关的蛋白，但这些相互作用的功能相关性大多还不清楚。此外，TTBK2 对轴突长度控制的分子机制也尚未明确。而且，TTBK2 的截断突变会引发脊髓小脑共济失调 11 型（SCA11），这是一种罕见的进行性神经退行性疾病，但其分子病理机制至今不明。

为了深入了解 TTBK2 在人类细胞中除启动纤毛形成之外的作用，来自未知研究机构（文中未明确第一作者单位信息）的研究人员开展了一系列研究。研究人员发现，TTBK2 对 KIF2A 的调节是控制纤毛伸长和维持的重要机制。并且，在特定条件下，TTBK2 在母中心粒富集以启动纤毛发生的这一过程可以被绕过，这揭示了其关键伙伴 CEP164 在不依赖 TTBK2 招募情况下的功能。这一研究成果为理解原发性纤毛形成的分子机制以及相关疾病的发病机制提供了新的重要线索，有望为相关疾病的治疗开辟新的方向。该研究成果发表于未提及期刊（文中未明确发表期刊信息）。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在细胞模型构建方面，通过构建多种细胞系，如 hTERT RPE-1 细胞系及其 KO 细胞系、HEK293T 细胞系等，为研究提供了不同的细胞研究环境。利用免疫沉淀（Immunoprecipitation）和质谱分析（MS/MS analysis）技术，对相关蛋白进行分离和分析，鉴定出 TTBK2 诱导的 KIF2A 磷酸化位点。借助免疫荧光显微镜（Immunofluorescence microscopy）和多种图像分析软件，对细胞内蛋白定位、纤毛数量和长度等进行观察和测量。同时，还运用了蛋白质印迹（Western blot）技术检测蛋白表达和磷酸化水平。

研究结果如下：

1. 截断的 TTBK2 蛋白生化活性降低：研究人员制备了两种截断的 TTBK2 构建体 TTBK2trunc1 和 TTBK2trunc2，通过蛋白质印迹实验发现，与野生型 TTBK2 相比，截断的 TTBK2 蛋白对 CEP164 和 Dishevelled-3（DVL3）的磷酸化能力明显减弱，但对 DVL3 仍具有一定的残余生化活性，并非完全失活。
2. 截断的 TTBK2 可触发纤毛组装：在 hTERT RPE-1 TTBK2 KO 细胞中诱导表达 TTBK2 构建体，结果显示 TTBK2trunc1 能够在约 11% 的细胞中挽救纤毛形成，尽管形成的纤毛长度明显短于野生型 TTBK2 挽救的纤毛。同时发现，TTBK2trunc1 无法被招募到 MC，而是分散在细胞质中，将其重新靶向到 MC 可恢复纤毛数量和长度。此外，在 CEP164 KO 细胞中，虽然 TTBK2 无法正常招募到 MC，但仍能偶尔形成原发性纤毛，且敲低 CEP164 会破坏 TTBK2trunc1 细胞中的纤毛组装，表明 CEP164 在纤毛形成过程中除招募 TTBK2 外还有其他重要作用。
3. TTBK2trunc1 纤毛较短但结构正常：运用透射电子显微镜（TEM）和扩展显微镜技术观察发现，TTBK2trunc1 细胞中的纤毛虽然较短，但在结构上没有明显的超微结构缺陷。在扩展显微镜下，可看到许多 TTBK2trunc1 条件下的纤毛与野生型类似，但轴突较短，且常出现 ARL13B 阳性小泡与 MC 结合但无轴突微管延伸的情况。
4. TTBK2trunc1 能触发早期纤毛发生：通过对早期纤毛发生相关蛋白的染色分析，发现 TTBK2trunc1 能够有效诱导 CP110 从 MC 移除，促进 IFT88 招募到 MC，并且使早期膜结构标记物 MyosinVa 和 RAB34 定位到 MC，表明截断的 TTBK2 能较好地触发纤毛组装级联反应的早期经典步骤。
5. TTBK2trunc1 中短纤毛与 KIF2A 积累有关：通过活细胞成像观察纤毛生长动力学，发现 TTBK2trunc1 细胞中的纤毛伸长缓慢，且存在较多纤毛断裂事件。研究人员聚焦于 KIF2A，发现其在 TTBK2trunc1 细胞的 MC 水平升高，与纤毛长度呈负相关。通过 siRNA 敲低 KIF2A，能够完全挽救 TTBK2trunc1 细胞中的纤毛长度缺陷，表明 KIF2A 积累与 TTBK2trunc1 细胞中纤毛形成缺陷有关。
6. KIF2A 过激活模拟 TTBK2 截断表型：构建 DOX 诱导表达 GFP-KIF2Awt 或 GFP-KIF2AKVD 的 hTERT RPE-1 细胞系，发现 GFP-KIF2Awt 表达会导致纤毛长度缩短和纤毛细胞百分比降低，而 GFP-KIF2AKVD 则无此现象，表明 KIF2A 的活性会干扰纤毛组装，模拟了 TTBK2trunc1 细胞中的缺陷表型。
7. TTBK2 诱导的磷酸化抑制 KIF2A 与微管结合和去聚合：通过免疫沉淀和 MS/MS 分析鉴定出 KIF2A 的磷酸化位点，对这些位点进行突变后，利用总内反射荧光（TIRF）显微镜观察发现，模拟 S135 - 140 簇的磷酸化会减少 KIF2A 与微管的结合，并抑制微管去聚合，表明 TTBK2 介导的磷酸化调节 KIF2A 与微管的相互作用。
8. TTBK2 在细胞中调节 KIF2A 支持纤毛形成：通过荧光漂白恢复（FRAP）分析、免疫荧光染色和比较不同 KIF2A 磷酸化突变体细胞中的纤毛形成情况，发现 TTBK2 磷酸化可使 KIF2A 在基体的池不稳定，防止其在纤毛基部积累，从而支持轴突的有效生长。而截断的 TTBK2 磷酸化 KIF2A 效率较低，导致 KIF2A 在纤毛基部积累，进而缩短纤毛长度。

在讨论部分，研究人员指出，TTBK2 的 C 端区域对其与 CEP164 的相互作用至关重要，而截断的 TTBK2 对不同底物的磷酸化存在差异，这可能与它的相互作用能力受损有关。研究还发现 KIF2A 不仅存在于 MC，还可在纤毛内的轴突微管上检测到，其在纤毛内的存在有助于解释纤毛的吸收机制。此外，TTBK2 对 KIF2A 的调节机制为理解纤毛形成提供了新的视角，并且在特定条件下，TTBK2 在 MC 富集启动纤毛发生的要求可以被绕过，这一发现挑战了一些现有的模型，暗示了可能存在其他调节机制。同时，研究也提出了一些有待进一步研究的问题，如 TTBK2 与远端附件在调节原发性纤毛组装中的具体合作机制等。

总的来说，这项研究揭示了 TTBK2 在原发性纤毛形成过程中的重要作用机制，尤其是其对 KIF2A 的调节作用以及在特定条件下纤毛发生启动的新机制，为深入理解原发性纤毛相关疾病的发病机制和潜在治疗靶点提供了重要依据。