富脯氨酸15在非小细胞肺癌中的表达及功能作用

　　

探寻肺癌治疗新靶点：富含脯氨酸蛋白 15 在非小细胞肺癌中的关键作用

南京医科大学附属无锡人民医院胸外科等多单位的研究人员，包括 Yong Ji、Han Zhang 等，在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “The expression and functional role of proline-rich 15 in non-small cell lung cancer” 的论文。该研究首次深入探究富含脯氨酸蛋白 15（PRR15）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况、功能意义及潜在机制，为 NSCLC 的诊疗开辟了新方向，有望推动肺癌精准治疗领域的发展，为患者带来新的希望。

一、研究背景

NSCLC 是肺癌的主要类型，约占所有肺癌病例的 85%，包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌等组织学类型。其发病受遗传和环境因素共同影响，如长期接触烟草烟雾及其他致癌物。尽管目前针对 NSCLC 的治疗手段多样，涵盖手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等，但由于多数患者确诊时已处于晚期，预后往往较差。因此，寻找新的早期诊断标志物和更有效的治疗靶点迫在眉睫。

在肿瘤治疗领域，分子靶向药物凭借针对特定基因改变的精准治疗模式，显著改变了 NSCLC 的治疗格局。像针对表皮生长因子受体（EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（ALK）、ROS1、BRAF、MET 和 RET 等基因突变的抑制剂，已在部分 NSCLC 患者中取得良好疗效。然而，这些靶向治疗也面临诸多挑战，如耐药机制的产生、预测生物标志物难以精准识别等，严重限制了其临床应用效果，进一步凸显了探索新型治疗靶点的重要性。

PRR15 作为一种在胎盘发育中起关键作用的核蛋白，此前在肿瘤研究领域关注度较低。虽有研究表明其在胃肠道肿瘤、乳腺癌和结肠腺癌等疾病中存在异常表达，但在 NSCLC 中的具体功能尚未明确。本研究旨在填补这一空白，深入剖析 PRR15 在 NSCLC 中的作用机制，为临床治疗提供新的思路和靶点。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

研究中所使用的多种试剂和抗体，如嘌呤霉素、细胞培养基、胎牛血清、Matrigel 基质等均购自知名公司。细胞系方面，A549 NSCLC 细胞系由苏州大学的徐博士提供，同时还使用了来自三位患者的原发性 NSCLC 细胞（pNSCLC - 1、pNSCLC - 2 和 pNSCLC - 3）以及两位患者的原发性人肺上皮细胞（pEpi1 和 pEpi2）。此外，23 例原发性 NSCLC 患者的新鲜癌组织及相邻正常肺组织也为研究提供了重要样本。

（二）实验方法

1. 蛋白与基因检测技术：运用蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）测定组织和细胞中的蛋白表达水平；采用定量实时聚合酶链反应（qPCR）检测 mRNA 水平。

2. 基因编辑技术：利用慢病毒介导的短发夹 RNA（shRNA）干扰技术降低 PRR15 表达，同时使用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 PRR15 基因敲除细胞模型，以探究 PRR15 对 NSCLC 细胞功能的影响。

3. 细胞功能检测：借助 CCK - 8 检测细胞活力，通过克隆形成实验评估细胞的增殖能力，运用核 EdU/TUNEL 染色检测细胞增殖与凋亡情况，采用 “Transwell” 实验测定细胞迁移能力，利用比色法检测 Caspase - 3/9 活性，通过 JC - 1 染色评估线粒体膜电位，使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞色素 c 含量。

4. 动物实验：选用 BALB/c 裸鼠构建异种移植模型，将经过基因修饰的原发性 NSCLC 细胞皮下注射到裸鼠体内，监测肿瘤生长情况，并对肿瘤组织进行免疫组织化学（IHC）和 TUNEL 染色分析。

5. 数据分析：所有体外实验均设置五个重复，数据以均值 ± 标准差（SD）表示。使用 SPSS 软件进行统计分析，组间比较采用非配对 Student's t 检验或单因素方差分析（ANOVA），以 P < 0.05 为差异具有统计学意义。

（三）关键技术路线

研究人员首先收集 NSCLC 患者组织样本和细胞系，检测 PRR15 的表达情况。接着，运用基因编辑技术对 PRR15 进行敲低或过表达处理，观察其对 NSCLC 细胞增殖、迁移、凋亡等生物学行为的影响。随后，深入探究 PRR15 影响 NSCLC 细胞功能的潜在分子机制，聚焦于对 Akt - mTOR 信号通路的调控作用。最后，通过裸鼠异种移植实验在体内验证 PRR15 的功能及作用机制，为研究结论提供更有力的支持。

三、研究结果

（一）PRR15 表达与临床相关性

通过对 TCGA 数据库分析发现，NSCLC 肿瘤组织中 PRR15 水平显著高于正常肺实质。进一步研究表明，PRR15 表达与患者生存状态、吸烟史、疾病分期、转移状态及治疗反应密切相关。高 PRR15 表达的 NSCLC 患者总体生存率明显降低，提示其可作为潜在的预后生物标志物。

（二）单细胞 RNA 测序分析

利用公开的单细胞 RNA 测序数据集进行分析，结果显示 PRR15 在 NSCLC 肿瘤的恶性细胞群体中高表达，在肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）亚型中尤为明显。此外，在淋巴结转移、脑转移的 LUAD 组织以及 LUAD 胸腔积液样本的上皮细胞群体中，PRR15 也呈现高表达，表明其在肿瘤细胞中的特异性表达，为靶向治疗提供了潜在靶点依据。

（三）NSCLC 组织和细胞中的 PRR15 表达

对 23 例原发性 NSCLC 患者的组织样本分析发现，NSCLC 肿瘤组织中 PRR15 的 mRNA 和蛋白表达水平均显著高于相邻正常组织。同时，在多种原发性和永生化的 NSCLC 细胞中，PRR15 表达也明显上调，而在正常肺上皮细胞中表达较低，进一步证实了 PRR15 在 NSCLC 中的异常高表达情况。

（四）PRR15 shRNA 的抗癌作用

在 pNSCLC - 1 细胞中使用靶向 PRR15 的 shRNA，有效降低了 PRR15 的 mRNA 和蛋白水平。功能实验表明，PRR15 沉默显著抑制了 pNSCLC - 1 细胞的生长、克隆形成能力和迁移能力，同时降低了细胞活力，减少了 EdU 阳性细胞核的比例，下调了与迁移相关的蛋白 Vimentin 的表达。在其他原发性 NSCLC 细胞和 A549 细胞中，PRR15 shRNA 同样表现出抑制细胞增殖和迁移的作用，而在正常肺上皮细胞中则无明显影响，表明 PRR15 shRNA 对 NSCLC 细胞具有特异性抗癌作用。

（五）PRR15 shRNA 诱导细胞凋亡

研究发现，PRR15 shRNA 处理 pNSCLC - 1 细胞后，Caspase - 3 和 Caspase - 9 活性显著增加，同时引发 Caspase - 3 和 PARP1 的裂解，细胞色素 c 释放到胞质中，线粒体膜电位下降，TUNEL 阳性细胞核比例显著上升，表明细胞凋亡明显增加。在其他原发性 NSCLC 细胞和 A549 细胞中也观察到类似现象，而在正常肺上皮细胞中未出现，说明 PRR15 沉默可特异性诱导 NSCLC 细胞凋亡。

（六）PRR15 敲除的抗癌效果

运用 CRISPR/Cas9 技术成功构建 PRR15 基因敲除的 pNSCLC - 1 细胞系。功能检测显示，PRR15 敲除显著抑制了细胞的增殖、克隆形成和迁移能力，同时导致线粒体膜电位下降，细胞凋亡增加，进一步验证了 PRR15 在 NSCLC 细胞进展中的重要作用，表明敲除 PRR15 可有效抑制 NSCLC 细胞的恶性行为。

（七）PRR15 过表达促进细胞生长

将携带 PRR15 表达载体的慢病毒导入 pNSCLC - 1 细胞及其他原发性 NSCLC 细胞和 A549 细胞中，成功构建 PRR15 过表达细胞系。结果显示，PRR15 过表达显著增强了 NSCLC 细胞的增殖和迁移能力，增加了 EdU 阳性细胞核的比例和克隆形成数量，表明 PRR15 在 NSCLC 细胞生长中具有促进作用，与敲低或敲除实验结果相互印证，进一步明确了 PRR15 的功能。

（八）PRR15 对 Akt - mTOR 激活的影响

研究表明，PRR15 的沉默或敲除显著降低了 Akt（Ser - 473）和 S6K（Thr - 389）的磷酸化水平，而过表达 PRR15 则增加了 Akt - S6K 的磷酸化水平。在 PRR15 沉默的细胞中导入组成型激活的 Akt1（caAkt1），可恢复 Akt - S6K 的磷酸化，并减轻 PRR15 沉默对细胞增殖、迁移和凋亡的抑制作用。此外，PRR15 沉默还降低了 HER2 蛋白表达，恢复 HER2 水平可部分挽救 Akt - S6K 的磷酸化，表明 PRR15 通过调节 HER2 表达至少部分促进 Akt - mTOR 激活，揭示了 PRR15 影响 NSCLC 细胞进展的关键分子机制。

（九）PRR15 沉默抑制裸鼠肿瘤生长

将携带 shPRR15 - 1# 或对照 shRNA 的 pNSCLC - 1 细胞皮下注射到裸鼠体内，构建异种移植模型。结果显示，shPRR15 - 1# 组肿瘤体积和重量明显小于对照组，同时 PRR15 沉默导致肿瘤组织中 Akt - mTOR 通路抑制，Ki - 67 阳性细胞核比例降低，细胞增殖减少，细胞色素 c 水平升高，Caspase - 3 和 PARP1 裂解增加，TUNEL 阳性细胞核比例上升，细胞凋亡增加，在体内实验中进一步验证了 PRR15 在 NSCLC 生长中的重要作用及靶向 PRR15 的潜在治疗效果。

四、研究结论与讨论

本研究证实 PRR15 在 NSCLC 中高表达，且与不良临床结局密切相关，是潜在的新型治疗靶点和诊断生物标志物。功能研究表明，PRR15 对 NSCLC 细胞的增殖、迁移和凋亡具有关键调控作用，其作用机制与激活 Akt - mTOR 信号通路密切相关。这一发现为深入理解 NSCLC 的发病机制提供了新视角，也为开发针对 NSCLC 的靶向治疗策略提供了重要理论依据。

当前 NSCLC 的靶向治疗虽取得一定进展，但耐药性和生物标志物识别等问题限制了治疗效果。PRR15 的发现为解决这些问题带来新契机。针对 PRR15 的靶向治疗有可能克服现有靶向药物的局限性，为 NSCLC 患者提供更有效的治疗方案。同时，PRR15 作为诊断生物标志物，有助于更精准地筛选高风险患者，实现早期诊断和个性化治疗，从而改善患者的预后。未来研究可进一步探索针对 PRR15 的特异性抑制剂或靶向药物，评估其在临床治疗中的安全性和有效性，有望为 NSCLC 的治疗带来新的突破，推动肺癌精准医学的发展，为广大肺癌患者带来新的希望。