PROS1通过AKT/GSK3β/β-catenin通路抑制膀胱癌进展和血管生成的机制研究

　　

兰州大学第二医院研究揭示 PROS1 抑制膀胱癌进展新机制

近期，兰州大学第二医院泌尿外科等单位的研究人员在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Mechanistic insights into PROS1 inhibition of bladder cancer progression and angiogenesis via the AKT/GSK3β/β-catenin pathway” 的研究论文。该研究对深入理解膀胱癌的发病机制、探寻潜在治疗靶点以及改善患者预后具有重要意义，为膀胱癌的研究和治疗开辟了新方向。

一、研究背景

膀胱癌（BLCA）是全球十大常见癌症之一，严重威胁人类健康。2022 年，全球超 61 万人确诊膀胱癌，相关死亡超 22 万例，在男性中发病率位居第 6，死亡率位居第 9 。非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）约五分之一会进展为肌层浸润性膀胱癌（MIBC），MIBC 患者 50% 最终发生转移。目前，膀胱癌治疗面临诸多挑战，免疫检查点阻断（ICB）疗法虽有前景，但仅少数患者有效，且易出现耐药，疾病复发率和死亡率高，缺乏可靠的早期诊断和预后评估工具。

肿瘤血管生成在癌症发展中至关重要，为肿瘤细胞提供营养和氧气，促进其生长和转移 。抗血管生成治疗联合免疫检查点抑制剂成为潜在治疗策略，因此，明确血管生成相关基因（ARGs）在膀胱癌中的作用意义重大。PROS1 是一种维生素 K 依赖蛋白，在凝血和纤溶过程中发挥重要作用，且在多种肿瘤中表达异常，但在膀胱癌中的作用及机制尚不明确。

二、研究材料与方法

（一）数据收集

从 TCGA 和 GEO 数据库获取膀胱癌样本的 RNA 测序及临床病理数据，从以往研究中提取蛋白质组数据，确定 36 个具有预后意义的 ARGs。

（二）患者样本收集

收集兰州大学第二医院 45 例膀胱癌患者（28 例 NMIBC 和 17 例 MIBC）手术中的配对肿瘤及癌旁组织，随访 2 - 24 个月，获取患者知情同意并经伦理委员会批准。

（三）实验方法

1. 细胞实验：使用多种膀胱癌细胞系（J82、5637、UMUC - 3、T24）和人尿道上皮细胞系（SV - HUC - 1），进行细胞转染、CCK8 实验、集落形成实验、细胞周期分析、迁移和侵袭实验、体外共培养及 Matrigel 管形成实验等，探究 PROS1 对膀胱癌细胞生物学行为的影响。

2. 分子生物学实验：采用 RNA 提取、定量实时聚合酶链反应（RT - qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测相关基因和蛋白表达；进行转录组测序分析 PROS1 过表达后基因表达变化及相关信号通路。

3. 动物实验：构建裸鼠肿瘤异种移植模型，将过表达 PROS1 的 J82 细胞和对照细胞皮下注射到裸鼠体内，观察肿瘤生长情况，进行组织学分析和免疫组化染色。

4. 数据分析：运用 R 软件进行生物信息学分析，ImageJ 和 GraphPad Prism 软件进行统计分析，P < 0.05 为差异具有统计学意义。

（四）关键技术路线

1. 通过对 TCGA - BLCA 和 GSE13507 数据集进行分析，基于 36 个 ARGs 进行共识聚类分析，确定膀胱癌的血管生成亚组。

2. 整合多组学数据，筛选出 PROS1 作为关键研究基因，分析其在膀胱癌组织和正常组织中的表达差异，以及与临床病理特征和预后的关系。

3. 构建 PROS1 过表达和敲低细胞模型，进行体外功能实验，研究 PROS1 对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成的影响。

4. 对 PROS1 过表达细胞进行转录组测序，结合 Western blotting 等实验，探究其作用的分子机制。

5. 构建体内肿瘤模型，验证 PROS1 在体内对肿瘤生长的抑制作用。

三、研究结果

（一）膀胱癌血管生成亚组的确定

基于 36 个 ARGs 对膀胱癌患者进行共识聚类分析，将患者分为 C1 和 C2 两个亚组。PCA 分析进一步验证了两组间的差异。生存分析显示，C2 组患者预后较好，而 C1 组患者预后较差。同时，两组在 ARGs 表达和临床特征方面存在显著差异。该结果通过对 TCGA - BLCA 和 GSE13507 数据集的分析得出，揭示了膀胱癌在血管生成相关基因表达模式上的异质性，为后续研究提供了基础。

（二）PROS1 在膀胱癌中的关键作用及与临床结局的相关性

通过整合多组学数据，确定 PROS1 为关键研究基因。分析多个数据库发现，膀胱癌组织中 PROS1 mRNA 和蛋白表达水平显著低于正常组织，且在多种肿瘤类型中均存在 PROS1 表达下调现象。进一步研究发现，PROS1 表达与肿瘤分级、病理 T 分期显著相关。生存分析表明，PROS1 高表达患者总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）显著延长，多因素 Cox 回归分析显示 PROS1 上调是膀胱癌预后的保护因素。此结论基于对 TCGA、GEO 等数据库的分析以及临床样本的检测，明确了 PROS1 在膀胱癌中的重要预后价值。

（三）PROS1 亚组的分子特征

对 PROS1 亚组进行差异基因表达分析，确定了 100 个与 PROS1 表达相关的差异表达基因（DEGs）。GO 和 KEGG 富集分析显示，这些基因参与肌肉细胞细胞骨架、神经活性配体 - 受体相互作用、PI3K - AKT 信号通路等多个生物学过程和信号通路，DO 富集分析表明其与膀胱疾病相关。该结果通过对 TCGA 队列的分析得出，揭示了 PROS1 亚组的潜在生物学功能和相关信号通路。

（四）PROS1 与免疫细胞浸润的相关性

分析不同 PROS1 表达组的免疫细胞浸润情况，发现高表达组的基质评分、免疫评分和估计核心评分更高。CIBERSORT 分析显示，高表达组中 M2 巨噬细胞、M0 巨噬细胞和静息 CD4 记忆 T 细胞数量较多，低表达组中滤泡辅助 T 细胞、活化树突状细胞、CD8 T 细胞和浆细胞数量较多。此外，高表达组中多个免疫检查点（如 TIGIT、PD - 1 等）表达水平更高。对接受抗 PD - L1 治疗的膀胱癌患者数据分析发现，无应答者 PROS1 表达更高，提示 PROS1 可能作为免疫治疗疗效的预测指标。这些结论通过对免疫细胞浸润分析和临床免疫治疗数据的研究得出，揭示了 PROS1 在膀胱癌免疫调节中的重要作用。

（五）PROS1 体外抑制膀胱癌的细胞生长

在多种膀胱癌细胞系中，J82 和 T24 细胞 PROS1 表达较低，UMUC - 3 细胞表达较高。构建 PROS1 过表达和敲低细胞模型后，CCK8 和集落形成实验表明，PROS1 过表达显著抑制 J82 和 T24 细胞生长和集落形成能力，敲低则促进 UMUC - 3 细胞增殖。细胞周期分析显示，PROS1 过表达使细胞阻滞在 G1 期，敲低则促进细胞从 G1 期向 S 期进展，同时影响细胞周期相关蛋白表达。该结果通过细胞系实验得出，证明了 PROS1 对膀胱癌细胞生长的抑制作用及其机制。

（六）PROS1 抑制膀胱癌的细胞迁移和侵袭

Transwell 实验表明，PROS1 过表达显著降低 J82 和 T24 细胞的迁移和侵袭能力，敲低则增强 UMUC - 3 细胞的这些能力。同时，PROS1 表达变化影响上皮 - 间质转化（EMT）相关蛋白和基质金属蛋白酶（MMP - 9）的表达。该结论基于 Transwell 实验和相关蛋白检测，揭示了 PROS1 对膀胱癌细胞迁移和侵袭的调控作用。

（七）PROS1 过表达抑制体外肿瘤血管成熟

研究发现 PROS1 与 VEGFA 在膀胱癌标本中呈负相关。RT - qPCR 和 Western blotting 检测显示，PROS1 过表达下调 VEGFA 表达，敲低则上调其表达。体外共培养实验表明，PROS1 过表达抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）管形成，敲低则促进其形成。该结果通过对数据库分析、细胞实验和相关检测得出，证明了 PROS1 在肿瘤血管生成中的抑制作用。

（八）通过 RNA 测序鉴定 PROS1 靶点

对 PROS1 过表达的 J82 细胞进行 RNA 测序，发现与对照组相比，1122 个基因下调，393 个基因上调。GO 和 KEGG 分析显示，这些差异表达基因在多个生物学过程、细胞成分和分子功能中富集，PI3K - AKT 信号通路显著富集。该结论基于转录组测序和生物信息学分析，为探究 PROS1 作用机制提供了线索。

（九）PROS1 激活膀胱癌中的 AKT/GSK - 3β/β - catenin 信号通路

Western blotting 检测发现，PROS1 过表达或敲低影响 AKT、GSK - 3β 和 β - catenin 的磷酸化水平。给予 AKT 激活剂 SC79 处理后，部分逆转了 PROS1 过表达对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成的抑制作用。该结果通过 Western blotting 和细胞功能实验得出，表明 AKT/GSK - 3β/β - catenin 信号通路参与 PROS1 对膀胱癌细胞的调控。

（十）PROS1 在体内抑制肿瘤发生

将过表达 PROS1 的 J82 细胞和对照细胞皮下注射到裸鼠体内，结果显示，过表达组肿瘤大小、体积和重量均显著小于对照组。组织学分析和免疫组化染色表明，过表达组肿瘤细胞生长减缓，肿瘤血管成熟度降低。该结论通过动物实验得出，证实了 PROS1 在体内的抑癌作用。

四、研究结论与讨论

该研究表明，PROS1 在膀胱癌中表达下调，与不良预后相关。PROS1 通过影响细胞增殖、侵袭、迁移和血管生成，在膀胱癌发展中起关键作用，其调控作用可能通过 AKT/GSK3β/β - catenin 信号通路介导。这一发现揭示了 PROS1 作为膀胱癌潜在治疗靶点的重要价值，为膀胱癌的治疗提供了新的方向。

研究还发现 PROS1 与肿瘤微环境中的免疫细胞浸润和免疫检查点表达相关，可能作为免疫相关生物标志物，为膀胱癌免疫治疗策略的制定提供参考 。此外，PROS1 在尿液中存在，支持其作为膀胱癌非侵入性生物标志物的潜力，符合当前液体活检技术的发展趋势。

然而，研究存在一定局限性。部分数据依赖公共数据库，存在数据质量、信息过时等问题，结论需在更大规模和多样化队列中验证。生物信息学分析提示的免疫相关功能需进一步实验证实，体内外模型无法完全模拟人类肿瘤的复杂性，将研究成果转化为临床实践还需更多验证研究。

尽管如此，该研究首次全面揭示了 PROS1 在膀胱癌中的重要作用和机制，为膀胱癌的诊断、治疗和预后评估提供了重要理论依据和潜在靶点，对推动膀胱癌精准医学发展具有重要意义。未来研究可针对现有局限性展开，进一步深入探究 PROS1 的功能和应用，有望为膀胱癌患者带来更好的治疗效果。