基于FRET和bret的阿片受体构象传感器揭示激动剂诱发的阿片受体激活动力学

本研究描述了基于FRET和bret受体构象传感器的阿片受体家族的发展。这些传感器进一步揭示了μ阿片受体强烈依赖激动剂的激活动力学。

　　

基于 FRET 和 BRET 技术的阿片受体构象传感器：揭示激动剂诱导的受体激活动态

德国马尔堡大学药理学与临床药学系的 Sina B. Kirchhofer、Claudia Kurz 等研究人员在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Dynamics of agonist-evoked opioid receptor activation revealed by FRET- and BRET-based opioid receptor conformation sensors” 的论文。该研究开发出基于 FRET 和 BRET 的阿片受体构象传感器，为深入研究阿片受体激活机制提供了重要工具，有助于理解阿片类药物作用差异，对开发更安全有效的镇痛药意义重大。

一、研究背景

阿片受体家族在疼痛缓解中至关重要，其中 μ 阿片受体（MOR）是治疗急性和严重疼痛的主要靶点。阿片类药物，包括天然、半合成和合成的，通过作用于阿片受体发挥镇痛作用，但常伴有严重副作用，如呼吸抑制和成瘾。美国阿片类药物危机凸显了其滥用和过量使用的高风险，2021 年因阿片类药物过量死亡人数超 8 万。不同阿片类镇痛药化学结构和受体激活特性各异，理解它们在信号传导不同方面的作用十分必要。

阿片受体激活会引发一系列细胞内事件，如激活 Gi/o 蛋白，导致 Gα 亚基上 GDP 被 GTP 取代，引发异源三聚体 G 蛋白解离或重排，进而抑制腺苷酸环化酶，降低 cAMP 水平，或激活离子通道。同时，激活的受体 C 末端会被 GRKs 磷酸化，招募抑制蛋白，诱导受体内化、降解或再循环。此前研究虽已揭示不同阿片类药物在信号传导不同阶段的差异，但在受体水平检测阿片受体构象变化的 FRET 或 BRET 报告系统尚未成功应用（除纯化的 MOR 外）。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

实验使用多种细胞系和试剂。细胞系为 HEK293T 或 HEK293 细胞，由维尔茨堡大学 Lohse 实验室馈赠。试剂包括各类培养基成分、抗生素、阿片类药物（如 DAMGO、吗啡等）、荧光素酶底物 6HF - Colenterazine 等。实验所需的多种质粒，如大鼠 μ 阿片受体（MOR - wt）、人 κ 阿片受体、人 δ 阿片受体、人伤害感受素 / 孤啡肽 FQ 受体等相关质粒，部分自行构建，部分购自 Addgene 或密苏里科技大学 cDNA 资源中心。

（二）实验方法

1. 质粒构建：运用 NEBuilder Hifi DNA 组装试剂盒构建多种质粒，如 MOR - FRET 传感器、MOR - BRET 传感器、KOR 和 NOP 的 FRET 及 BRET 传感器等。构建过程涉及特定引物设计，通过 PCR 扩增目的片段，经酶切、连接等步骤完成质粒构建，引物设计借助 SnapGene Viewer 软件，由 Eurofins Genomics 合成。
2. 细胞培养：在添加 10% 胎牛血清、2 mM L - 谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 0.1 mg/ml 链霉素（或 0.4 mg/ml G418 用于筛选）的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO?条件下培养细胞。实验前，HEK293T 细胞用 Effectene 转染试剂或 PEI 试剂进行瞬时转染，不同实验转染的质粒及用量不同，转染后培养 48 h 用于后续检测。
3. 检测方法
   • 单细胞 FRET 测量：在配备特定物镜、光源和相机的倒置显微镜下进行。用 435 nm 光激发 CFP，同时收集 CFP 和 YFP 荧光发射。细胞用外部缓冲液或激动剂溶液持续灌流，测量在室温下进行，数据采集借助 NIS - Elements 高级研究成像软件。
   • 酶标仪多细胞 FRET 测量：在 Tecan Spark 20 M 酶标仪中，对稳定表达 MOR - FRET 传感器的细胞进行测量。激发 CFP 后，分别在 485 nm 和 535 nm 记录供体（CFP）和受体（YFP）荧光，测量后用 Excel 计算 YFP/CFP 发射比。
   • BRET 测量：使用 Tecan Spark 20 M 酶标仪，转染细胞后，测量前更换培养基、洗涤细胞，加入含 6H - F - Colenterazine 的外部缓冲液孵育。测量时记录基线 BRET，添加激动剂溶液或缓冲液，再添加饱和浓度 DAMGO 或缓冲液，测量不同阶段的供体（nLuc）和受体（YFP）发光，计算（nLuc/CFP）发光比，数据处理借助 Excel 和 GraphPad Prism 7 软件。
   
   
4. 数据分析：FRET 测量数据用 OriginPro 2016 校正光漂白，单细胞 FRET 数据还用 Excel 校正背景荧光、CFP 渗漏到 YFP 通道及 YFP 的假激发。使用 GraphPad Prism 7 软件进行浓度 - 响应曲线、抑制曲线拟合，计算相关参数（如 EC??、IC??、Ki 等），并进行统计分析，差异显著性以 P ≤ 0.05 判断。

（三）关键技术路线

基于 FRET 和 BRET 原理，在阿片受体特定位置插入荧光团构建受体构象传感器。以 MOR 为例，在第三胞内环插入黄色荧光蛋白变体（sYFP），在截短的 C 末端插入青色荧光蛋白变体（mTurquoise2）构建 FRET 传感器；将 mTurquoise2 替换为纳米荧光素酶（NLuc2）构建 BRET 传感器。利用这些传感器，在单细胞水平和微孔板格式下，检测不同阿片类激动剂诱导的受体构象变化，分析受体激活和失活动力学。

三、研究结果

（一）μ 阿片受体 FRET 构象传感器的构建

为开发针对 MOR 的 FRET 受体构象传感器，研究人员借鉴先前用于血栓素 A?受体的方法，在大鼠 MOR 的第三胞内环不同位置插入 sYFP，在截短的 C 末端插入 mTurquoise2。将构建的多种质粒转染至 HEK293T 细胞，检测细胞膜定位和激动剂诱导的 FRET 变化。结果显示，在不同插入位点的构建体中，在 G267 位点插入 sYFP 的构建体表现最佳，激动剂诱导的 FRET 发射比变化约 6%，且主要在质膜表达，因此选择该构建体作为后续研究的 MOR FRET 传感器。

（二）新建立的 MOR 传感器的表征

建立稳定表达 MOR FRET 构象传感器的 HEK293 细胞系，在 96 孔微孔板中用酶标仪进行 FRET 测量。通过应用不同浓度的 DAMGO，随后用饱和浓度 DAMGO 归一化和拮抗剂纳洛酮处理，生成浓度 - 响应曲线，确定多种阿片类激动剂的半最大有效浓度（EC??）。计算出纳洛酮的 IC??为 2.7 nM，Ki 为 1.1 nM，与文献相符。

为比较 MOR FRET 传感器与其他信号通路检测的差异，进行基于 BRET 的实验，测量激动剂诱导的 arrestin3 与受体的相互作用及 G 蛋白激活。结果表明，MOR FRET 传感器检测的 EC??值比受体 - arrestin 相互作用的 EC??值高约 1 - 5 倍（部分激动剂吗啡和丁丙诺啡除外），而 MOR 诱导的 G 蛋白激活的 EC??值在低 nM 范围，且与传感器相比左移明显。这些结果表明新构建的 MOR FRET 受体构象传感器可在生理范围内检测多种阿片类药物，适用于微孔板高通量分析。

（三）MOR FRET 受体构象传感器揭示的配体特异性激活动力学

在显微镜下对 MOR FRET 传感器进行单细胞测量，以 10 Hz 的高频率测量不同激动剂诱导的 MOR 激活和失活动力学。应用 100 μM 饱和浓度的激动剂，达到激活平台期后用细胞外缓冲液洗脱。对数据进行单指数拟合，计算激活半衰期和失活半衰期、失活速率常数（Koff）及激活速率常数（Kon）。

结果显示，肽类激动剂 DAMGO 和 Met - enkephalin 激活半衰期较短，但呈双相动力学；吗啡和丁丙诺啡激活半衰期较长，且丁丙诺啡存在明显激活延迟。DAMGO、Met - enkephalin、芬太尼和吗啡的失活半衰期小于 10 s，美沙酮和丁丙诺啡大于 20 s。芬太尼的失活速率最快，美沙酮和丁丙诺啡最慢。计算得出的 Kon 与激动剂亲和力相关，亲和力高的激动剂激活速率快，而失活速率与激动剂亲和力或效能无明显相关性。通过与检测受体与 G 蛋白相互作用的 FRET 实验对比，发现两种方法在检测 DAMGO 诱导的激活时具有一致性，但吗啡与 G 蛋白相互作用的激活更快，且受体与 G 蛋白解离的洗脱期更长，失活动力学更慢。

（四）该方法可应用于相关受体

鉴于大鼠 MOR 的 FRET 和 BRET 受体构象传感器功能良好，研究人员将该策略应用于阿片受体家族其他成员。选择人 κ 阿片受体（KOR）、人 δ 阿片受体（DOR）和人伤害感受素 / 孤啡肽 FQ 受体（NOP），在其第三胞内环 G 位点插入 sYFP，截短 C 末端并插入 mTurquoise2 构建 FRET 传感器。对转染 KOR 或 NOP FRET 传感器的 HEK293T 细胞进行显微镜检测，发现传感器定位于细胞膜，激动剂诱导约 6% 的 FRET 变化。

在 96 孔板中用酶标仪记录浓度 - 响应曲线，得到 KOR 内源性激动剂强啡肽 A 的 EC??为 219 nM，NOP 内源性激动剂伤害感受素的 EC??为 63 nM，与文献相符。为 KOR 和 NOP 构建 BRET 受体构象传感器，KOR 的 BRET 传感器成功检测到激动剂诱导的 BRET 比变化，且与 FRET 传感器的 EC??值高度可比，但 NOP 的 BRET 传感器未成功开发，DOR 的 FRET 和 BRET 传感器构建均未成功，因构建体在细胞膜表达不足。

四、研究结论与讨论

本研究成功开发出基于 FRET 和 BRET 的阿片受体构象传感器，可用于 μ 阿片受体（MOR）、κ 阿片受体（KOR）和伤害感受素 / 孤啡肽 FQ 受体（NOP）的研究（DOR 传感器开发失败）。这些传感器在单细胞测量和微孔板高通量检测中均表现良好，能直接解析受体激活动力学。

MOR FRET 传感器揭示了不同阿片类激动剂的激活速率差异，激活速率与激动剂亲和力相关，而失活速率与亲和力或效能无明显关联。这表明 MOR 配体的激活动力学具有高度配体特异性，而失活动力学无明显配体特异性。这些差异可能源于不同阿片类激动剂与受体的相互作用不同，以及诱导的受体构象不同。

与以往的 MOR 传感器相比，本研究的 FRET 传感器具有诸多优势，如在细胞膜表达良好、在生理 pH 下工作、能被多种阿片类激动剂激活并揭示实时激活动力学。同时，将 FRET 传感器的设计理念应用于 BRET 传感器，使传感器适用于多种检测方式。

该研究成果为阿片受体家族的研究提供了重要工具，有助于进一步理解阿片类药物的作用机制，从单细胞分析到微孔板检测，不仅能提供药物与受体亲和力信息，还能反映药物激活受体的效能。这对于开发更安全有效的镇痛药，减少阿片类药物的副作用具有重要意义，为后续药物研发和临床应用提供了理论基础和技术支持。