靶向MDM2影响痉挛蛋白水平和功能：对热休克治疗的影响

　　

靶向 MDM2 对痉挛蛋白水平与功能的影响：为遗传性痉挛性截瘫治疗带来新曙光

近期，意大利国家研究委员会分子生物学与病理学研究所（隶属于罗马第一大学）的 Francesca Sardina 等人在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “Targeting MDM2 affects spastin protein levels and functions: implications for HSP treatment” 的研究论文。这一研究成果意义重大，它为深入理解遗传性痉挛性截瘫（Hereditary Spastic Paraplegia，HSP）的发病机制及开发潜在治疗策略提供了关键线索。

研究背景

HSP 是一种常见的神经退行性运动神经元疾病，约 40% 的病例是由 SPG4 基因单倍体不足导致的，该基因编码的痉挛蛋白（spastin）水平降低是主要病因。多数致病性 SPG4 - HSP 变异为截断突变，致使痉挛蛋白水平下降，进而影响细胞内运输过程，如微管（MT）动力学和受体分选。维持细胞内合适的痉挛蛋白水平至关重要，因此，寻找提升痉挛蛋白水平的策略成为治疗 HSP 的潜在方向，而明确影响痉挛蛋白水平和功能的因素与途径则是关键所在。

痉挛蛋白存在 M1 和 M87 两种主要异构体，由于翻译起始位点不同而产生。M87 普遍存在且含量丰富，M1 仅在神经元组织中低水平表达。二者都能与 MT 结合形成六聚体，这对 MT 切断功能不可或缺。此外，还有 M1Δ4 和 M87Δ4 等可变剪接形式。所有异构体都包含共同结构域，其中 MT 结合域（MTBD）、ATP 酶域以及 MT 相互作用和运输域（MIT），在细胞分裂和间期都发挥着重要作用，参与胞质分裂时的胞质分裂脱落和内体运输等过程。当痉挛蛋白缺乏时，细胞会出现胞质分裂延迟，表现为细胞间通过长细胞内桥（ICB）连接的积累；在间期，回收小管无法与分选内体分离，导致转铁蛋白受体（TfR1）等货物降解，而非返回质膜，影响铁摄取等神经元功能。

鼠双微体 2（MDM2）是一种 E3 泛素连接酶，主要作为 p53 肿瘤抑制蛋白的负调节因子被熟知。但它也具有 p53 非依赖性功能，通过转录、翻译后修饰、蛋白质降解、与辅助因子结合和亚细胞定位等多种机制调节其他靶标，参与细胞周期调控、应激反应和神经元可塑性等生理过程，在多种疾病中也发挥着作用。研究人员在筛选恢复痉挛蛋白水平的相关因子时，发现 MDM2 下调与痉挛蛋白表达增加有关，这为后续研究奠定了基础。

研究材料与方法

1. 细胞培养与处理：研究使用了多种细胞系，包括 HeLa、H1299、HeLa HIPK2 null、SH - SY5Y、NSC - 34、p53?/mdm2??小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）以及患者来源的携带 SPG4 基因突变的淋巴母细胞系（LCL - SPG4）等。细胞培养在适宜的培养基中，并添加 10% 热灭活胎牛血清。实验中使用 Nutlin - 3a（MDM2 的特异性抑制剂）处理细胞，同时设置溶剂 DMSO 作为对照。
2. RNA 干扰（RNAi）技术：设计针对 MDM2 和痉挛蛋白的特异性 siRNAs，利用 Lipofectamine RNAi MAX 转染细胞，以实现对相关基因表达的下调，从而研究其对细胞内蛋白水平和功能的影响。
3. 表达载体与转染：使用多种表达载体，如 pCMV - MDM2、pCMV - MDM2ΔRing、pEF - Ub - HA、pCMV6 - spastin - DDK - MYC 等。通过 Lipofectamine LTX 和 Plus reagent 将载体转染到细胞中，用于过表达或突变表达相关蛋白。
4. 蛋白检测技术：采用蛋白质免疫印迹（WB）和免疫沉淀（IP）技术检测细胞内蛋白表达水平和蛋白间相互作用。使用特定抗体识别目的蛋白，通过 ECL Prime 显色，Image Lab 软件进行图像采集和密度分析。
5. 体外结合实验：表达并纯化 GST 和 GST - MDM2 蛋白，与重组痉挛蛋白或其片段进行孵育，通过 WB 检测结合情况，以确定 MDM2 与痉挛蛋白的直接结合作用。
6. 显微镜分析：利用共聚焦显微镜观察细胞形态和蛋白定位，通过对标记后的细胞进行成像分析，研究细胞内的生理过程变化，如胞质分裂和 TfR1 分选情况。同时使用原位邻近连接测定（isPLA）检测蛋白间的相互作用。
7. 生物信息学分析：运用 AlphaFold2 预测痉挛蛋白的结构，PepThreader 预测与 MDM2 相互作用的肽段，通过肽 - 蛋白对接评估相互作用亲和力，辅助确定 MDM2 与痉挛蛋白相互作用的关键区域。

研究技术路线

研究人员首先通过 RNAi 技术下调 MDM2 表达，观察其对痉挛蛋白水平的影响，验证两者之间的关联。接着，利用多种实验手段，如免疫沉淀、体外结合实验和生物信息学分析，探究 MDM2 与痉挛蛋白是否存在直接相互作用以及相互作用的区域。随后，研究 MDM2 对痉挛蛋白多聚泛素化的调控方式，明确其是否依赖催化活性。最后，使用 MDM2 抑制剂 Nutlin - 3a 处理细胞，评估其对痉挛蛋白水平以及相关细胞功能缺陷的改善作用，从而探索靶向 MDM2 在治疗 HSP 中的潜在价值。

研究结果

1. MDM2 下调增加痉挛蛋白水平：研究人员使用 MDM2 特异性 siRNAs 转染 HeLa 细胞，24 小时后通过 WB 检测发现，与对照组相比，MDM2 下调的细胞中痉挛蛋白水平显著增加。为排除 p53 和 HIPK2 的影响，在 p53 缺失的 H1299 细胞和 HIPK2 缺失的 HeLa 细胞中进行同样实验，结果显示 MDM2 下调依然能使痉挛蛋白水平明显上升。这表明 MDM2 介导的痉挛蛋白调控机制不依赖于 p53 网络的激活，也与 HIPK2 介导的磷酸化无关，是一条新的影响痉挛蛋白水平的途径。
2. MDM2 与痉挛蛋白结合并以催化非依赖方式调节其多聚泛素化：分析 MDM2 下调和对照细胞中痉挛蛋白的 mRNA 水平，发现 MDM2 下调虽使痉挛蛋白蛋白表达增加，但 mRNA 水平却略有下降，说明 MDM2 并非通过转录调控痉挛蛋白表达。通过共免疫沉淀实验，发现内源性 MDM2 能与痉挛蛋白 - DDK - MYC 共沉淀，而与阴性对照 DDK - MYC 不结合，且两者在细胞质和细胞核中存在共定位，表明 MDM2 与痉挛蛋白在细胞内形成复合物。借助 AlphaFold2 预测痉挛蛋白结构，结合肽 - 蛋白对接分析，发现痉挛蛋白的 MIT 域存在多个与 MDM2 高亲和力的肽段区域。进一步通过体外 pull - down 实验证实，痉挛蛋白全长异构体、剪接异构体 Δ4 以及包含 MIT 域的片段都能直接与 GST - MDM2 结合。在细胞内痉挛蛋白泛素化实验中，siMDM2 细胞中痉挛蛋白多聚泛素化水平低于对照细胞，且过表达 MDM2 全长和缺失 E3 泛素环结构域的突变体（MDM2ΔRing）对痉挛蛋白水平的降低作用相似，说明 MDM2 以催化非依赖的方式调节痉挛蛋白的多聚泛素化和蛋白水平。
3. 靶向 MDM2 可恢复痉挛蛋白水平并减少痉挛蛋白缺陷细胞中的胞质分裂和受体分选缺陷：用 Nutlin - 3a 处理 HeLa、H1299、SH - SY5Y、NSC - 34 细胞以及患者来源的 SPG4 - LCLs 细胞，发现这些细胞中的痉挛蛋白水平均显著增加。在 p53 和 mdm2 双敲除（DKO）细胞中，Nutlin - 3a 处理对痉挛蛋白水平无影响，证实了该抑制剂对 MDM2 调节痉挛蛋白水平的靶向性。在模拟痉挛蛋白单倍体不足的实验中，通过 RNAi 下调 HeLa 细胞中痉挛蛋白水平，导致细胞出现胞质分裂延迟（表现为 ICB 连接细胞积累）和 TfR1 分选缺陷。而 Nutlin - 3a 处理后，这些缺陷得到明显改善，细胞胞质分裂阶段的细胞数量显著减少，TfR1 蛋白水平回升，同时细胞对荧光 FtH 纳米载体的摄取增强，进一步表明 TfR1 分选功能得到恢复。

研究结论与讨论

本研究首次鉴定出 MDM2 是痉挛蛋白的新型相互作用蛋白，它能够调节痉挛蛋白的多聚泛素化和蛋白水平。MDM2 对痉挛蛋白的调节机制独立于 HIPK2 和 p53，且不依赖其泛素连接酶活性。MDM2 与痉挛蛋白 MIT 域存在直接相互作用，尽管可能还有其他结构域参与其中。

这一发现为痉挛蛋白的调控机制增添了新的层面，拓展了人们对影响痉挛蛋白水平因素的认知，对开发提升 HSP 患者痉挛蛋白水平的治疗策略具有重要意义。MDM2 作为一个有潜力的药物靶点，在癌症及其他疾病治疗研究中备受关注。Nutlin - 3a 作为 MDM2 抑制剂，不仅能增加多种细胞中痉挛蛋白的水平，还能改善痉挛蛋白缺陷细胞的功能，这为 HSP 的治疗提供了新的潜在方向。

然而，目前的研究存在一定局限性，主要基于细胞培养实验。未来需要进一步在 SPG4 - HSP 神经元和动物模型中评估 MDM2 抑制的效果，深入探究 MDM2 在神经系统中的功能和调控机制。由于痉挛蛋白与许多其他 HSP 相关基因相互关联，持续研究 MDM2 在神经系统中的作用，有助于更深入地理解 SPG4 - HSP 及其他类型 HSP 的发病机制，为开发更有效的治疗方法奠定基础。

总之，该研究为 HSP 的治疗提供了新的靶点和理论依据，有望推动 HSP 治疗领域的发展，为患者带来新的希望。