d -2-羟戊二酸通过表观遗传重编程损害DNA修复

肿瘤代谢物D-2-HG与损害DNA修复途径有关。在这里，作者表明D-2-HG导致全基因组DNA超甲基化和CTCF覆盖的丧失，这损害了同源重组DNA修复机制的组装和相关的拓扑调整。

　　

D-2 - 羟基戊二酸通过表观遗传重编程损害 DNA 修复机制的研究解读

美国国立癌症研究所神经肿瘤学分支的 Fengchao Lang 等研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “D-2-hydroxyglutarate impairs DNA repair through epigenetic reprogramming” 的论文。该研究揭示了致癌代谢物 D-2 - 羟基戊二酸（D-2-HG）影响 DNA 修复的新机制，为深入理解癌症发生发展过程中的基因组不稳定现象提供了关键线索，也为 IDH 突变相关癌症的治疗策略开发提供了理论依据，具有重要的科学和临床意义。

一、研究背景

异柠檬酸脱氢酶（IDH1/2）突变在多种人类癌症中频发，如胶质瘤、白血病、软骨肉瘤和胆管癌等。IDH 突变后会产生致癌代谢物 D-2-HG，其能竞争性抑制 α- 酮戊二酸（αKG）依赖的双加氧酶，从而显著影响细胞生物学过程和疾病进展。在 IDH 突变的恶性肿瘤中，DNA 修复功能常受损，这类肿瘤对 DNA 修复抑制剂敏感，呈现出 “BRCAness” 特征，但 D-2-HG 影响 DNA 修复通路的具体机制尚未完全明晰。同时，IDH 突变引发的表观遗传改变与肿瘤发生密切相关，D-2-HG 抑制去甲基化酶，导致 DNA 甲基化状态改变，影响基因表达和 3D 基因组结构，然而这种表观遗传景观的变化与 DNA 修复活性受损之间的关系也有待探究。此外，染色质重塑在 DNA 修复过程中发挥着关键作用，其通过调节染色质结构影响 DNA 修复酶对损伤位点的可及性，但 D-2-HG 对这一过程的影响尚不明确。

二、研究材料与方法

（一）细胞系与试剂

使用了 U251 MG、U2OS DRGFP 等细胞系，患者来源的胶质瘤干细胞（GSCs）BT054 和 BT142 。实验用到多种试剂，如 TMZ、DMSO、Octyl-(R)-2HG、Octyl-α-KG 等。

（二）实验方法

1. HR/NHEJ 报告基因检测：构建融合蛋白 DD-Sce-I-GR 表达载体并转导至 DRGFP U2OS 细胞系，通过配体诱导 Sce-I 监测 DNA 损伤修复蛋白招募动力学及同源修复（HR）效率；利用 EJ5 和 EJ7-GFP 报告细胞系检测非同源末端连接（NHEJ）效率。
2. DSB 诱导及相关检测：构建 IDH 野生型或 R132H 突变的 DSB 诱导型 AsiSI 细胞系（DIvA），用 4-OHT 诱导 DNA 双链断裂（DSB） 。采用蛋白质免疫印迹（Western blotting）、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、免疫荧光（Immunofluorescence）等技术检测相关蛋白表达、相互作用及定位。
3. 其他检测方法：运用激光微辐射（Laser micro-irradiation）观察 DNA 损伤位点蛋白招募；通过斑点印迹（Dot blotting）、甲基化 DNA 免疫沉淀（MeDIP）和羟甲基化 DNA 免疫沉淀（hMeDIP）分析 DNA 甲基化和羟甲基化状态；借助染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、染色体构象捕获测序（4C-seq）探究染色质结构和相互作用；利用 RNA 干扰（RNA interference）和 CRISPR - cas9 技术进行基因功能研究；采用彗星实验（Comet assay）评估 DNA 损伤程度；运用 qPCR 量化末端切除；通过流式细胞术（Flow cytometry）分析细胞相关指标。

三、研究结果

（一）D-2-HG 通过抑制 TET1/2 损害 HR DNA 修复

研究人员通过时间进程实验，对比 IDH1 野生型和 R132H 突变的 DIvA 细胞中 γH2A.X 焦点数量，发现突变细胞中 γH2A.X 焦点持续时间更长，且这种损伤修复缺陷并非由 NHEJ 通路缺陷导致。在胶质瘤细胞系中，IDH1 的 R132C 或 R132H 变异使细胞在暴露于替莫唑胺（TMZ）或卡莫司汀（BCNU）等基因毒性剂时，γH2A.X 斑点形成和修饰水平显著增加，且该现象可被 IDH 突变新功能活性抑制剂 ivosidenib（AG-120）逆转。此外，D-2-HG 处理后，细胞的 γH2A.X、磷酸化 ATM（pATM）修饰增强，DNA 片段化增加，这些变化可被 αKG 逆转。彗星实验表明，TET1 或 TET2 的异位表达可减轻 TMZ 和 D-2-HG 诱导的 DNA 损伤；TET1/2 敲除细胞系中，TMZ 诱导的 DNA 片段化更严重，补充 TET1/2 可挽救这一现象。诱导型 DRGFP 报告系统显示，D-2-HG 抑制 HR，αKG 或 TET1/2 过表达可恢复 HR 效率。

（二）D-2-HG 抑制 TET1/2 改变 DNA 损伤区域蛋白招募

通过微辐射实验发现，D-2-HG 抑制同源重组（HR）修复蛋白 BRCA2 和 RAD51 向 γH2A.X 位点的招募，该现象可被 αKG 或 TET1/2 过表达逆转。在 DD-Sce-I-GR DRGFP 报告细胞和经 TMZ 处理的 U251 细胞中也观察到类似现象，ChIP PCR 检测进一步证实，D-2-HG 存在时，BRCA2 和 RAD51 在 DNA 损伤位点的覆盖减少，而 γH2A.X 的结合增强，且这种影响具有位点特异性，仅在 DSB 近端区域出现。

（三）胞嘧啶高甲基化阻碍 CTCF 结合及 HR 复合物组装

D-2-HG 积累导致基因组范围的 CpG 岛高甲基化表型（CIMP），使 TET1/2 活性丧失，5hmC 水平降低。MeDIP/hMeDIP 分析显示，D-2-HG 处理后，Sce-I 位点近端区域 5mC 积累，5hmC 水平下降，αKG 可纠正这种失衡。微辐射实验证实，D-2-HG 抑制激光诱导 DSB 位点的 5hmC 积累，αKG 或 TET1/2 过表达可挽救。CTCF 作为多功能核蛋白，在 DNA 修复过程中受染色质甲基化状态影响，D-2-HG 抑制 CTCF 向 Sce-I 诱导的 DSB 位点招募，αKG 或 TET1/2 过表达可使其恢复。功能缺失研究表明，敲低 CTCF 导致 RAD51 从染色质上解离，激光微辐射实验也证实，CTCF 基因沉默会损害 BRCA2 和 RAD51 向 DNA 损伤区域的招募。ChIP 富集实验揭示了 DSB 诱导后，γH2A.X、CTCF、BRCA2 和 RAD51 在 DSB 位点的富集顺序，D-2-HG 破坏了这一正常招募序列，αKG 或 TET1/2 过表达可部分挽救。在基因组脆弱位点的研究发现，D-2-HG 导致阿非迪霉素（APH）诱导的 DNA 损伤增加，与 BRCA2/RAD51/CTCF 招募缺失有关，补充 αKG 或 TET1/2 可部分修复损伤。

（四）D-2-HG 通过抑制 TET1 和 TET2 影响 HR DNA 修复复合物组装

通过邻近连接分析（PLA）可视化和量化 CTCF 引导的 HR 修复复合物的物理相互作用，发现 TMZ 处理增强了 RAD51、BRCA2 和 CTCF 之间的亲和力，而 D-2-HG 显著削弱了这种相互作用，αKG 或 TET1/2 过表达可部分恢复。TET1/2 对 RAD51-CTCF、RAD51-BRCA2 和 BRCA2-CTCF 相互作用的组装至关重要，TET1/2 敲除细胞中 PLA 信号焦点减少，重新表达 TET1/2 可增加这些相互作用的斑点数量。免疫共沉淀实验进一步证实，D-2-HG 抑制 IDH 野生型细胞中 CTCF/BRCA2/RAD51 复合物的形成，αKG 或 TET1/2 过表达可挽救；在 IDH 突变细胞中，AG-120 可恢复该复合物的形成。此外，CTCF 缺失会削弱 RPA 向 DNA 断裂处的招募，IDH 突变细胞的末端切除效率降低，D-2-HG 损害 Mre11 和 CtIP 之间的相互作用，TET1 催化结构域过表达可挽救这些现象。

（五）IDH 突变胶质瘤干细胞的 DNA 损伤反应缺陷

在患者来源的胶质瘤干细胞 BT054 和 BT142 中，过表达 TET1/2 减少了未解决的 DNA 断裂，表现为 γH2A.X 斑点减少和 RAD51 向 DNA 损伤位点的招募增加，激光微辐射后的实时成像显示，D-2-HG 处理延迟或完全抑制了 RFP-RAD51 向 DSB 位点的招募，αKG 可恢复招募。IDH 突变的 GSC 细胞对 TMZ 更敏感，αKG 处理或 TET1/TET2 过表达可逆转这种敏感性，减少细胞凋亡并增强克隆形成能力，抑制突变的 IDH1 可增加 GSC 细胞对 TMZ 的抗性。

（六）IDH 突变破坏 DNA 损伤位点周围的环形成

IDH 突变导致 H3K9me3 高甲基化，影响 DNA 损伤修复蛋白向 DSB 位点的招募。在 DRGFP 细胞中，DSB 诱导后 H3K9me3 水平迅速增加，TADs 作为 γH2A.X 修饰和 DSB 修复复合物组装的支架结构，IDH 突变会破坏其正常功能。研究发现，IDH1 R132H 突变的 DIvA 细胞中，与野生型相比，γH2A.X 和 53BP1 斑点显著增加，ChIP 实验证实 DSB 位点附近 CTCF 覆盖减少，4C-seq 显示 IDH 突变细胞中 DNA 损伤位点周围的染色质相互作用显著减弱，CTCF 敲低进一步减少染色质相互作用，TET1 催化结构域过表达可恢复 CTCF 结合和染色质相互作用。甲基化特异性亚硫酸氢盐测序表明，IDH1 R132H 细胞中 CTCF 峰值降低的位置，胞嘧啶甲基化显著升高，TET1 催化结构域过表达可挽救 DDR 因子的招募和 D-2-HG 诱导的 5mC 高甲基化。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

本研究表明，致癌代谢物 D-2-HG 通过抑制 TET1/2 的去甲基化酶活性，导致 DNA 高甲基化，阻碍 CTCF 与 DNA 损伤位点的结合，进而破坏染色质结构和 DNA 修复复合物的组装，最终损害 HR DNA 修复。这揭示了 IDH 突变相关癌症中 DNA 修复受损的一种新的表观遗传机制，强调了 TET1/2 和 CTCF 在维持基因组稳定性和 DNA 修复过程中的关键作用。

（二）讨论

1. 癌症代谢与治疗敏感性：癌细胞通过代谢重编程满足增殖需求，D-2-HG 作为致癌代谢物，不仅引发全基因组表观遗传变化，促进癌症侵袭性表型，还损害 DNA 修复通路。IDH 突变的胶质瘤对 DNA 修复抑制剂敏感，本研究进一步明确了 D-2-HG 在其中的作用机制，为开发针对这类肿瘤的精准治疗策略提供了理论基础 。
2. CTCF 在 DNA 修复中的作用：CTCF 作为关键的表观遗传调节因子，在 DNA 修复过程中起着不可或缺的作用。它通过组织染色质结构，促进 HR 修复元件向 DSB 位点的招募和组装。D-2-HG 介导的 CTCF 结合缺失和染色质相互作用减弱，严重影响了 DNA 修复效率，凸显了维持 CTCF 功能对基因组稳定性的重要性。
3. “BRCAness” 的新机制：“BRCAness” 是癌症的一种独特表型，以往研究认为 IDH 突变通过影响组蛋白甲基化和 DNA 修复蛋白招募导致 “BRCAness”。本研究发现，TET1/2 介导的胞嘧啶去甲基化在调节染色质构象和 DNA 修复蛋白招募中起关键作用，为解释 IDH 突变恶性肿瘤中 “BRCAness” 的形成提供了新的平行机制，有助于深入理解癌症的发生发展过程，并为靶向治疗提供新的潜在靶点。

该研究系统地揭示了 D-2-HG 损害 DNA 修复的机制，为癌症治疗领域开辟了新的研究方向，未来进一步开展基于患者来源模型和体内研究，将有助于更全面地了解 IDH 突变癌症与 DNA 修复抑制剂敏感性之间的关系，推动癌症精准治疗的发展。