Blimp-1在脓毒症中通过嘌呤生物合成调控巨噬细胞极化和代谢稳态

　　

Blimp-1 在脓毒症中调控巨噬细胞极化与代谢稳态的研究解读

首都医科大学附属北京地坛医院北京市新发传染病实验室、北京传染病研究所等单位的研究人员 Wenjuan Peng、Qiushi Qin、Rui Li 等，在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Blimp-1 orchestrates macrophage polarization and metabolic homeostasis via purine biosynthesis in sepsis” 的论文。该研究揭示了 B 淋巴细胞诱导成熟蛋白 -1（Blimp-1）在脓毒症中调控巨噬细胞极化和代谢稳态的新机制，为脓毒症的治疗提供了潜在的新靶点，对深入理解脓毒症的病理生理过程和开发新的治疗策略具有重要意义。

一、研究背景

脓毒症是一种危及生命的疾病，全球每年约有 4890 万人患病，2017 年导致 1100 万人死亡，占全球总死亡人数的 19.7%。其发病机制复杂，涉及感染、炎症、缺氧和代谢重编程等多种途径，其中炎症反应失衡是关键机制。在脓毒症早期，机体处于高度炎症状态，大量炎症介质损伤组织和免疫细胞；晚期则出现免疫抑制，导致免疫麻痹和严重感染复发。

巨噬细胞在脓毒症诱导的器官功能障碍中起着关键作用，其分为促炎（M1）和抗炎（M2）两种功能亚群。在脓毒症早期，IFN-γ 和 LPS 诱导 M1 巨噬细胞极化，释放大量炎症因子，如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6，导致严重炎症反应和器官损伤；晚期 IL-4 和 IL-13 激活 M2 巨噬细胞，分泌大量 IL-10、TGF-β 等抗炎细胞因子，引发免疫抑制。因此，了解巨噬细胞极化的调控机制对阐明脓毒症病理和探索新的免疫治疗方法至关重要。

Blimp-1 是一种由 Prdm1 基因编码的 IFN-β 转录抑制因子，在单核细胞向巨噬细胞分化中发挥作用，且可抑制多种炎症细胞因子的产生。然而，其在巨噬细胞极化中的潜在调控作用以及在脓毒症中的意义尚未明确。此外，能量代谢在调节巨噬细胞极化和功能中起关键作用，M1 巨噬细胞主要依赖糖酵解供能，M2 巨噬细胞则更多依赖线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环，Blimp-1 可能通过细胞代谢途径调节巨噬细胞极化，进而影响脓毒症的炎症反应。

二、研究材料与方法

1. 细胞培养：从 6 - 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠分离骨髓细胞，培养获得 M0 巨噬细胞，再分别用 LPS 和 INF-γ、IL-4 和 IL-13 诱导分化为 M1、M2 巨噬细胞。RAW264.7、293T 和 THP-1 细胞也在相应培养基中培养，THP-1 细胞用 PMA 诱导分化为 M0 巨噬细胞。
2. 病毒载体构建：定制携带 shRNA-Blimp-1 或 shRNA-NC 的腺相关病毒（AAV），构建巨噬细胞靶向的 AAV。将 Blimp-1 RNAi 序列和对照序列分别连接到相应质粒，与辅助质粒共转染 AAV-293 细胞，包装并纯化重组 AAV9 颗粒。
3. 动物模型：选取 6 - 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，采用盲肠结扎穿孔（CLP）手术建立脓毒症模型。术后给予皮下注射无菌生理盐水补液，通过呼吸状态、活动和对刺激的反应、眼睛外观等指标监测小鼠状态。实验中对小鼠进行 AAV 注射干预，部分小鼠在 CLP 术后给予 L - 谷氨酰胺腹腔注射。
4. 检测方法：包括流式细胞术检测细胞表面标志物和转录因子；LEGENDplexTM MU 巨噬细胞 / 小胶质细胞检测板检测细胞因子；自动分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶；H&E 染色评估肝肺组织损伤；RNA 提取、逆转录和实时 PCR 检测基因表达；构建质粒进行转染和双荧光素酶报告基因检测；Seahorse XF 分析仪检测线粒体呼吸能力和糖酵解功能；非靶向和靶向代谢组学分析检测细胞代谢物。
5. 统计学分析：使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析，P < 0.05 为差异有统计学意义，通过 Kolmogorov-Smirnov 检验检查数据的正态性和方差齐性，根据数据分布选择 Student t 检验或 Mann-Whitney 非参数检验。

三、研究技术路线

研究人员首先建立 CLP 脓毒症小鼠模型，检测 Blimp-1 在巨噬细胞中的表达情况。然后通过 shRNA-Blimp-1 敲低 Blimp-1 表达，观察其对 CLP 小鼠生存率、组织损伤和巨噬细胞极化的影响。在细胞水平，对骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）、RAW264.7 和 THP-1 细胞进行实验，过表达或敲低 Blimp-1，研究其对巨噬细胞分化、极化和代谢的作用。利用代谢组学技术分析 Blimp-1 敲低后细胞代谢物的变化，通过双荧光素酶报告基因检测验证 Blimp-1 对相关代谢途径的调控。最后，通过给予谷氨酰胺代谢抑制剂 BPTES 和补充谷氨酰胺，探究嘌呤生物合成和鸟氨酸循环代谢调节在 Blimp-1 促进 M2 巨噬细胞极化中的作用。

四、研究结果

1. Blimp-1 在脓毒症相关巨噬细胞中表达升高：成功建立 CLP 脓毒症小鼠模型后，与假手术对照组相比，CLP 小鼠肝肺出现明显组织病理损伤，血清肝损伤生物标志物和炎症细胞因子水平升高。CLP 小鼠腹腔灌洗液（PLF）中巨噬细胞比例增加，且 Blimp-1 在 M2 巨噬细胞亚群中表达特异性升高，mRNA 水平也显著增加。这种选择性上调在 NK 细胞、γδ T 细胞和 M2 巨噬细胞中存在，在其他免疫细胞中不明显，表明 Blimp-1 主要在 PLF 的 M2 巨噬细胞中表达，在脓毒症中起重要作用。
2. Blimp-1 敲低加重脓毒症并损害 M2 极化：使用 shRNA-Blimp-1 敲低 Blimp-1 表达后，CLP 小鼠生存率显著降低，肝肺组织损伤加剧。PLF 中总巨噬细胞数量增加，但 M2 巨噬细胞比例减少，CD206 和 CD206+Blimp-1 细胞数量降低。利用巨噬细胞靶向的 AAV 敲低 Blimp-1，进一步证实了其对 M2 巨噬细胞极化的影响，且早期干预可观察到肺组织损伤增加，表明 Blimp-1 在脓毒症中的保护作用依赖于其对 M2 巨噬细胞极化的调节。
3. Blimp-1 促进单核细胞 - 巨噬细胞分化和 M2 极化：在巨噬细胞分化和极化过程中，Blimp-1 在单核细胞中的表达高于 B 细胞和粒细胞，且随着 BMDM 分化成熟，其 mRNA 水平逐渐升高。M2 巨噬细胞中 Blimp-1 mRNA 水平显著高于 M0 和 M1 巨噬细胞。在 THP-1 和 RAW264.7 细胞中过表达 Blimp-1，导致细胞形态呈现 M2 巨噬细胞特征，CD206 表达增加，M2 标记基因 mRNA 水平升高，表明 Blimp-1 在驱动巨噬细胞分化和获得 M2 表型中起关键作用。
4. Blimp-1 对 M2 巨噬细胞能量代谢至关重要：在 RAW264.7 细胞中敲低 Blimp-1，M2 巨噬细胞比例和 M2 标记基因 mRNA 水平显著降低，而 M1 巨噬细胞比例和标记基因 mRNA 水平无变化。Blimp-1 敲低还导致参与线粒体呼吸、脂肪酸氧化代谢和糖代谢的关键基因表达降低，过表达则使其升高。Seahorse XF 分析显示，敲低 Blimp-1 降低了 M2 巨噬细胞的线粒体氧消耗率和细胞外酸化率，表明其调节关键代谢酶表达，促进 M2 巨噬细胞极化。
5. Blimp-1 调节 M2 巨噬细胞代谢组：对 RAW264.7 细胞进行非靶向代谢组学分析，鉴定出 121 种代谢物。OPLS-DA 模型区分了 shRNA-Blimp-1 和 shRNA-NC 组的代谢物谱，热图显示两组在氨基酸和核苷酸方面存在显著差异。定量代谢组学分析发现 9 种差异核苷酸代谢物和 17 种差异氨基酸代谢物，代谢途径富集分析表明 Blimp-1 影响 M2 巨噬细胞中核苷酸和氨基酸的代谢途径。
6. Blimp-1 增强 M2 巨噬细胞中嘌呤生物合成和下游鸟氨酸循环：Blimp-1 敲低导致嘌呤生物合成途径中大多数代谢物下调，关键酶基因表达降低，鸟氨酸循环代谢物含量和关键酶 mRNA 水平显著减少，核苷酸代谢物 GDP、GTP、ATP 和 ADP 浓度也明显降低。双荧光素酶报告基因检测显示 Blimp-1 直接增强 PPAT、GDA 等关键酶基因启动子的转录活性，表明 Blimp-1 通过促进关键酶基因转录调节嘌呤生物合成和下游鸟氨酸循环。
7. 嘌呤生物合成和鸟氨酸循环代谢调节参与 Blimp-1 促进的 M2 巨噬细胞极化：用谷氨酰胺代谢抑制剂 BPTES 处理转染 Blimp-1 质粒的 BMDM，M2 巨噬细胞标记基因 Arg1 的 mRNA 水平显著降低；补充谷氨酰胺则使敲低 Blimp-1 的 BMDM 中 Arg1 mRNA 水平升高。补充谷氨酰胺还可提高巨噬细胞靶向 AAV shRNA-Blimp-1 处理的 CLP 小鼠生存率，增加 M2 巨噬细胞比例，表明嘌呤生物合成和鸟氨酸循环代谢调节在 Blimp-1 促进 M2 巨噬细胞极化和对脓毒症小鼠的影响中起关键作用。

五、研究结论与讨论

本研究表明，Blimp-1 在脓毒症中通过调节嘌呤生物合成和鸟氨酸循环，促进巨噬细胞向 M2 表型极化，从而调控代谢稳态和炎症反应，发挥对脓毒症的保护作用。这一发现揭示了 Blimp-1 在脓毒症病理过程中的新机制，拓展了对脓毒症中代谢与免疫反应相互作用的理解。

巨噬细胞极化在脓毒症病理生理学中起核心作用，已有研究表明 Nrf2、Krüppel 样转录因子等参与巨噬细胞极化调节。本研究进一步发现 Blimp-1 通过调节关键代谢酶表达，影响 M2 巨噬细胞极化。M2 巨噬细胞极化涉及多种代谢途径改变，Blimp-1 对脂肪酸、葡萄糖和氨基酸代谢相关酶的调节，影响了 M2 巨噬细胞的极化和功能。同时，Blimp-1 对嘌呤生物合成和鸟氨酸循环的调控，与谷氨酰胺代谢密切相关，谷氨酰胺作为关键枢纽，连接了不同代谢途径，影响 M2 巨噬细胞极化和脓毒症进程。

然而，本研究存在一定局限性。主要以动物模型为研究对象，需要在人体样本中进一步验证；由于缺乏合适的 ChIP 抗体，无法在体内评估 Blimp-1 与靶基因启动子的直接结合位点和强度；还需要纵向研究评估 Blimp-1 调节对脓毒症中免疫功能和宿主恢复的长期影响。

尽管如此，该研究仍具有重要意义。它为脓毒症的治疗提供了潜在的新靶点，Blimp-1 及其调控的代谢途径有望成为干预脓毒症的关键切入点，为开发新的治疗策略提供了理论依据，有助于推动脓毒症治疗领域的进一步发展。