肉桂皮质及其成分表儿茶素和芳樟醇对皮肤昼夜节律的调节作用

　　

肉桂皮及其成分对皮肤昼夜节律调节作用的研究解读

来自釜山国立大学（Pusan National University）分子生物学系和系统生物学研究所的 Ji-Young Kim、Juyeon Lee 等研究人员，在Scientific Reports期刊上发表了题为 “Modulatory effects of cinnamomi cortex and its components epicatechin and linalool on skin circadian rhythms” 的论文。该研究首次揭示了肉桂皮（cinnamomi cortex，CC）提取物及其成分表儿茶素（epicatechin，EC）和芳樟醇（linalool，LO）对皮肤角质形成细胞昼夜节律的调节作用，为改善皮肤健康和抗皮肤衰老的新型皮肤科治疗提供了潜在方向，在皮肤科学和天然药物研究领域具有重要意义。

研究背景

昼夜节律是由生物钟调节的近 24 小时生理周期，对维持生物体的内环境稳定至关重要。在人体中，皮肤作为最大的器官，直接暴露于外界环境变化中，其细胞（如角质形成细胞）具有自主生物钟，对维持皮肤的稳态和功能起着关键作用 。例如，表皮水分流失、角质细胞增殖、皮肤血流和皮肤温度调节等过程都呈现出昼夜变化规律。白天，皮肤的抗氧化物质生成和修复酶活性较高，有助于抵御紫外线辐射和环境污染物的损害；夜晚，随着光照减少，皮肤的昼夜节律切换到恢复和再生模式，促进细胞再生、胶原蛋白合成和血流增加。

然而，当这些细胞的昼夜节律被打乱时，会引发多种皮肤疾病，导致皮肤屏障功能受损，还可能出现皮肤过早衰老、伤口愈合不良和敏感性增加等问题。因此，调节皮肤昼夜节律成为皮肤病学研究的重点方向，对维持皮肤健康具有重要意义。目前，虽然已知某些植物化合物可以调节昼夜节律，具有开发新型治疗方法的潜力，但肉桂皮提取物及其生物活性成分对角质形成细胞昼夜节律的影响尚未得到充分研究。

研究材料与方法

细胞培养

研究使用人表皮角质形成细胞（HaCaT 细胞），将其培养在含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中，并置于湿度为 95%、含 5% CO?的 37℃培养箱中培养。

提取物和单一化合物的制备

实验所用的肉桂皮提取物购自韩国生物科学与生物技术研究所的韩国植物提取物库。该提取物按照制造商的说明，以 95% 乙醇为提取溶剂制备而成。研究还使用了 18 种已鉴定的肉桂皮单一成分，包括 (?)- 冰片、(?)- 石竹烯氧化物、(R)-(+)- 柠檬烯等，这些成分均购自 Sigma-Aldrich 公司。

细胞活力分析

将细胞以每孔个细胞的密度接种到 96 孔板中，过夜培养。分别在 24 小时和 72 小时后，使用 Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒，在有无测试提取物或化合物存在的情况下测定细胞活力，通过 Infinite M Nano 微孔板读数仪读取结果。

实时生物发光

对表达小鼠 BMAL1 启动子驱动荧光素酶的 HaCaT 细胞，先用 100 nM 地塞米松处理 2 小时进行同步化。然后，将培养基替换为含有 CC 提取物或浓度为 20、50、100 μM 的单一成分以及 100 μM 荧光素的新鲜培养基。使用光度计（Kronos HT）在四天内实时测量荧光素酶活性，并通过去趋势数据处理确定生物发光活性，利用在线平台 BioDare2 分析细胞昼夜节律的周期和振幅。

分子对接模拟

利用 CB-DOCK2 服务器进行分子对接模拟。通过腔体检测算法确定结合口袋，使用 AutoDock Vina 进行亲和力评分，并自动生成网格大小以适配结合口袋，将 RORA 与 EC 和 LO 进行对接。

RNA 定量

采用 TRIzol 试剂提取细胞中的总 RNA，使用 GoScript 逆转录酶和 oligo (dT) 引物进行逆转录。运用定量实时 PCR 技术，以 QuantStudio 3 实时 PCR 仪器和 SYBR Green PCR Master Mix 对 mRNA 水平进行定量分析。实验中大多数引物设计跨越外显子 - 外显子接头，以避免基因组 DNA 的扩增；对于不跨越接头的引物，采取额外的验证措施，并在逆转录前用 DNaseI 处理 RNA 样本以去除基因组 DNA 污染，同时通过凝胶电泳验证实时 PCR 产物大小，并利用熔解曲线分析确保扩增的特异性。

细胞内 ROS 水平测定

按照制造商的说明，使用荧光探针 CellROX Orange 试剂测定细胞内活性氧（ROS）水平。将 5 μM 的 CellROX 试剂加入培养细胞中，在 37℃孵育 30 分钟，再用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂进行核染色 5 分钟，最后使用 EVOS FL Auto 成像系统以 200 倍放大倍数获取荧光图像。

统计分析

运用 GraphPad Prism 软件进行统计分析。两组之间的比较采用双尾无配对 Student's t 检验；多组比较则使用单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 事后检验。对于昼夜节律钟基因表达中治疗组和时间点之间的相互作用评估，采用双因素 ANOVA，并使用?ídák 事后多重比较检验。设定为具有统计学意义，所有定量数据均以平均值 ± 标准误表示。

研究结果

CC 调节皮肤角质形成细胞的生物钟和节律

通过细胞活力实验发现，浓度为 100 μg/mL 及以下的 CC 提取物在处理细胞 24 小时或 72 小时后无细胞毒性，而 1000 μg/mL 的 CC 提取物则表现出细胞毒性。在对同步化的稳定表达 BMAL1 启动子驱动荧光素酶的 HaCaT 细胞进行实验时，CC 提取物处理后生物发光计数呈浓度依赖性增加。虽然 CC 提取物处理不影响昼夜节律的周期，但在 100 μg/mL 浓度下，昼夜节律的振幅显著增加，50 μg/mL CC 提取物处理的细胞昼夜节律振幅也有所增强，但差异无统计学意义。

进一步研究核心昼夜节律钟基因的表达水平发现，100 μg/mL 的 CC 提取物处理会降低隐花色素 1（CRY1）mRNA 水平，同时以时间依赖性方式增加 BMAL1、D-box 结合 PAR bZIP 转录因子（DBP）、核受体亚家族 1 D 组成员 1（NR1D1）和周期蛋白 2（PER2）的 mRNA 水平。此外，CLOCK、PER1 和 BMAL1 蛋白水平有所增加，但并非在所有时间点都有显著变化。这些结果表明，CC 提取物从细胞和分子层面调节了昼夜节律。

CC 的特定成分调节昼夜节律

对构成 CC 的 18 种单一成分进行细胞活力评估，发现大多数成分在浓度低于 100 μM 时无细胞毒性。在对同步化的 BMAL1::Luc HaCaT 细胞进行实时生物发光活性检测时，发现只有 EC 和 LO 这两种化合物能够改变昼夜节律，其他 16 种化合物则无此作用。EC 处理可增加生物发光活性，在 100 μM 浓度时最为显著，且该浓度下 EC 虽对昼夜节律周期影响不大，但显著增加了昼夜节律振幅。LO 处理同样使生物发光活性呈剂量依赖性增加，且在不改变周期的情况下显著增加了振幅。因此，EC 和 LO 被确定为 CC 提取物中调节昼夜节律的关键分子。

EC 和 LO 直接激活昼夜节律钟系统

由于 EC 和 LO 增强了 BMAL1 驱动的细胞昼夜节律振幅，研究人员利用 CBDOCK2 服务器模拟它们与核心时钟系统蛋白质的结合位点和亲和力。结果显示，EC 和 LO 对 RORA 蛋白（核受体 ROR alpha）具有最高的结合亲和力，Vina 评分分别为?9.1 和?5.6，表明 EC 与 RORA 可能存在强相互作用，而 LO 的结合相对较弱。使用 AlphaFold 3 进行的模拟也预测了 RORA 与 EC、RORA 与 LO 之间的结合，验证了研究结果的一致性。

鉴于 RORA 通过结合 ROR 元件辅助 BMAL1 启动子发挥功能，研究人员检测了 EC 或 LO 处理后 BMAL1 启动子的活性。结果发现，50 或 100 μM 的 EC 或 LO 处理显著增强了 BMAL1 启动子驱动的荧光素酶活性，且呈剂量依赖性。这表明 CC 提取物成分 EC 和 LO 可直接与 RORA 蛋白结合，增强其反式激活作用。

EC 和 LO 调节昼夜节律功能

研究人员检测了经 EC 或 LO 处理的同步化细胞中多个核心时钟基因的表达水平。结果显示，CC 提取物、EC 和 LO 处理均增加了 BMAL1 mRNA 水平；EC 处理未改变 CRY1 mRNA 水平，而 LO 处理使其下调，与 CC 提取物的作用相似；EC 处理增加了 DBP mRNA 水平，而 LO 处理无此效果；EC 和 LO 处理后 NR1D1 mRNA 水平略有增加，但并非在所有时间点都显著，CC 提取物对其影响更明显；CC 提取物增加了 PER2 mRNA 水平，而 EC 或 LO 处理的变化较小且不具有时间点普遍性。由此可见，EC 和 LO 改变了时钟基因的 mRNA 表达模式，但与 CC 提取物的作用方式略有不同。

EC 和 LO 调节皮肤细胞的抗氧化防御系统

考虑到昼夜节律与氧化应激控制相关，研究人员探究了 EC 和 LO 对角质形成细胞抗氧化系统的影响。用过氧化氢处理细胞会增加 CellROX 氧化应激试剂的荧光信号，表明 ROS 水平升高；而同时用 EC 或 LO 与过氧化氢共同处理细胞，则显著降低了 ROS 水平。进一步检测抗氧化酶的表达发现，过氧化氢和 EC 或 LO 共同处理细胞时，过氧化氢酶（CAT）表达增加；在氧化应激条件下，EC 显著增加超氧化物歧化酶 1（SOD1）的表达水平，LO 也能上调 SOD1，但作用程度小于 EC；EC 和 LO 均使超氧化物歧化酶 2（SOD2）的表达略有增加。这些结果表明，CC 提取物成分 EC 和 LO 具有调节昼夜节律和调节角质形成细胞抗氧化防御系统的潜力。

EC、LO 和 CC 提取物增强皮肤屏障功能

角质形成细胞在维持皮肤的完整性和保护功能中起关键作用，研究人员考察了 CC 提取物中生物活性化合物对皮肤屏障基因表达的影响。结果显示，LO 处理显著上调了编码丝聚蛋白（filaggrin）的 FLG 基因，该基因对角质网络形成和皮肤保湿至关重要，而 EC 对其无影响；转谷氨酰胺酶 1（TGM1）编码基因在 EC 或 LO 处理后表达无显著变化；编码桥粒斑蛋白（desmoplakin）的 DSP 基因在 EC 和 LO 处理后均显著上调，该蛋白对表皮完整性至关重要。

在评估神经酰胺合成相关基因时，发现 EC、LO 和 CC 提取物处理均显著上调了参与神经酰胺生成的关键基因 SPTLC1、SPTLC2 和 SPTLC3 的表达。在细胞衰老相关基因方面，EC 和 LO 处理对衰老相关基因 CDKN1A 和 CDKN1B 的表达无显著影响，但二者均增加了端粒酶逆转录酶（TERT）的转录水平。CC 提取物不仅抑制 CDKN1A 和 CDKN1B 的表达以防止细胞周期停滞，还增加了 TERT mRNA 水平。这些结果表明，EC、LO 和 CC 提取物通过增强结构完整性、增加神经酰胺水平和抑制细胞衰老来促进皮肤屏障功能。

研究结论与讨论

该研究表明，CC 提取物及其成分 EC 和 LO 对角质形成细胞的细胞和分子昼夜节律机制具有显著影响。CC 提取物能够以浓度依赖性方式增强昼夜节律振幅，100 μg/mL 时效果最佳，这一发现凸显了其对昼夜节律的强大调节作用，与先前研究中昼夜节律振幅调节与改善细胞功能、增强细胞对环境压力的抵抗能力的观点一致。

基因表达分析揭示了 CC 调节角质形成细胞生物钟的机制，其通过降低 CRY1 mRNA 水平，增加 DBP、NR1D1 和 PER2 水平，可能重新编程核心时钟基因的表达，从而增强生物钟的稳健性。EC 和 LO 作为 CC 中调节昼夜节律的活性成分，具有成为治疗剂的潜力。二者均能以剂量依赖性方式显著增加生物发光活性和昼夜节律振幅，与 CC 提取物的作用相似。通过分子对接结果推测，CC 和 LO 可能通过直接激活 RORA 来调节昼夜节律钟基因，但还需要进一步研究确定具体的结合区域并证实这种直接相互作用。

虽然 CC 提取物广泛上调了 DBP、NR1D1 和 PER2 等时钟基因，但 EC 和 LO 对这些基因的表达具有不同的影响，这表明它们的作用机制可能与 CC 提取物不同，各自在昼夜节律调节中发挥独特的作用。

已有研究证实昼夜节律时钟系统在管理氧化应激和维持皮肤屏障功能方面发挥着关键作用，而本研究中 CC 提取物及其成分 EC 和 LO 对角质形成细胞昼夜节律系统的调节作用，与上述已知的生理过程调节机制相符，暗示其对皮肤生理的影响可能至少部分通过调节昼夜节律来实现。为了进一步探究这些联系，研究人员计划开展染色质免疫沉淀实验，以确认 BMAL1/CLOCK 与抗氧化和脂质代谢基因启动子的结合；进行基因敲低实验，评估昼夜节律时钟破坏的直接影响；开展时间基因表达分析，研究 CC 提取物处理下关键途径的昼夜节律。

此外，对衰老相关基因的分析表明，EC 和 LO 通过激活端粒酶促进细胞寿命延长，这为其抗衰老作用提供了潜在机制。未来，研究人员计划利用 3D 人工皮肤组织模型，更深入地探究 CC 提取物及其成分 EC 和 LO 在调节皮肤相关过程（如昼夜节律调节、屏障功能和细胞修复）中的功能应用，进一步挖掘其在治疗各种皮肤疾病方面的潜力，为开发更具针对性和有效性的皮肤科治疗方法提供依据。

综上所述，该研究证明了 CC 提取物及其成分 EC 和 LO 在调节角质形成细胞昼夜节律、减少氧化应激和增强皮肤屏障功能方面具有显著潜力，为 CC 提取物在皮肤健康和抗衰老治疗中的潜在应用提供了有力证据，为新型皮肤科治疗的发展奠定了重要基础，但这些化合物在皮肤护理中的临床应用和长期益处仍有待进一步研究阐明。