CAR激动剂/ PXR拮抗剂联合MI-883在饮食诱导的高胆固醇血症模型中的降血脂作用

已知CAR和PXR受体调节代谢，然而，没有适合治疗的双人配体。在这里，作者展示了一种CAR激动剂/PXR拮抗剂MI-883，它通过在血浆胆固醇调节中利用CAR和PXR的激活来调节胆固醇/胆汁酸的稳态。

　　

靶向核受体的双功能化合物 MI-883 调节胆固醇稳态的研究解读

来自查尔斯大学药学院药理学与毒理学系等多个单位的研究人员在Nature Communications期刊上发表了题为 “The hypolipidemic effect of MI-883, the combined CAR agonist/PXR antagonist, in diet-induced hypercholesterolemia model” 的论文。该研究发现了一种新型化合物 MI-883，它作为组成型雄甾烷受体（CAR）激动剂和孕烷 X 受体（PXR）拮抗剂，在调节胆固醇和胆汁酸稳态方面展现出显著效果，为治疗高胆固醇血症等代谢性疾病提供了新的潜在策略，在药物研发和代谢性疾病治疗领域具有重要意义。

研究背景

CAR 和 PXR 属于 NR1I 家族，是与外源性物质敏感性相关的核受体，最初被认为主要参与外源性物质的清除。后来研究发现，它们在肝脏多种功能中发挥关键作用，包括胆汁酸、胆固醇、胆红素、脂质和葡萄糖的代谢与转运 。在胆固醇代谢方面，已有研究表明，激活小鼠的 Car 能改善高胆固醇血症，通过增加胆汁酸的合成、代谢和排泄，以及上调低密度脂蛋白（LDL）的清除，降低肝脏和血清胆固醇浓度。而 PXR 激活则与高胆固醇血症和肝脏脂肪变性相关，其激活会升高血浆 LDL 胆固醇水平，触发胆固醇合成的主调节因子 SREBP2 蛋白的核积累，激活 SREBP2-INSIG1-HMGCR 轴，还会增加肠道中前蛋白转化酶枯草溶菌素 9（PCSK9）和尼曼 - 皮克 C1 样蛋白 1（NPC1L1）的表达，刺激胆固醇合成。因此，同时激活 CAR 并抑制 PXR 可能是治疗高胆固醇血症的有前景的策略，但此前尚未有针对这两个受体的联合调节剂被设计出来。

研究材料与方法

1. 细胞系与细胞培养：使用多种细胞系，包括人肝癌细胞系 HepG2、猴成纤维样细胞系 COS-1、人结肠腺癌细胞系 LS174T、HepaRG 细胞及其敲除 CAR 或 PXR 的细胞系等。按照各自的培养条件进行细胞培养和分化，用于后续的实验研究。
2. 动物模型：选用人源化 PXR-CAR-CYP3A4/3A7 小鼠，分别给予高脂饮食（HFD）或高胆固醇饮食（HCD）诱导高胆固醇血症。部分实验还使用了 C57BL/6N 小鼠进行药代动力学研究，以及 PXB-mouse 人源化肝脏小鼠评估 MI-883 对人源化肝脏的影响。所有动物实验均遵循相关伦理准则进行。
3. 实验方法：采用多种实验技术，如 TR-FRET CAR 共激活剂结合测定、TR-FRET PXR 竞争性结合测定、荧光素酶报告基因测定、CAR 和 PXR-LBD 组装测定、哺乳动物双杂交辅因子相互作用测定、蛋白质印迹、RT-qPCR、mRNA 测序（RNA-Seq）、分子动力学模拟、脂质组学、胆汁酸代谢组学分析等，从分子、细胞、动物等多个层面研究 MI-883 的作用机制和效果。

研究技术路线

研究人员首先从化合物库中筛选出具有潜在 CAR 激动剂 / PXR 拮抗剂活性的 MI-883。通过一系列体外细胞实验，包括结合测定、报告基因测定等，验证其对 CAR 和 PXR 的作用活性。接着，在多种细胞模型中研究 MI-883 对胆固醇、胆汁酸代谢相关基因表达的影响。随后，利用人源化小鼠模型，给予 HFD 或 HCD 诱导高胆固醇血症，通过检测血浆和组织中的胆固醇、胆汁酸水平，以及相关基因和蛋白的表达，评估 MI-883 对胆固醇和胆汁酸稳态的调节作用。同时，进行药代动力学研究和毒性测试，评价 MI-883 的安全性和药代动力学特性。最后，通过分子动力学模拟等技术深入探究 MI-883 与 CAR 和 PXR 的相互作用机制。

研究结果

1. MI-883 作为双功能 CAR/PXR 配体：MI-883 是一种含氟衍生物，相较于化合物 39 和原型 CAR 激动剂 CITCO，其氟原子的存在保护吡啶环不被羟基化，显著延长了代谢稳定性和生物半衰期。在 TR-FRET CAR 共激活剂测定中，MI-883 表现出高效的 CAR 激活活性（） ，能显著刺激 CAR LBD 组装、CAR3 变体激活以及 EGFR-CAR+A 融合蛋白向细胞核的转运。在 TR-FRET PXR LBD 竞争性结合测定中，MI-883 能有效竞争荧光团与重组 PXR LBD 的结合（），并在荧光素酶报告基因测定中显著抑制 PXR 的激活。这些结果表明 MI-883 是一种有效的 CAR 激动剂和 PXR 拮抗剂。
2. MI-883 的药代动力学特性和临床前毒性测试：在 C57BL/6N 小鼠的药代动力学研究中，MI-883 腹腔注射和口服给药后的生物半衰期分别为 217 分钟和 170 分钟，主要分布在肝脏，经胆汁排泄。它是 CYP3A4 活性的弱抑制剂，但不抑制 CYP2B6 活性，且在报告基因测定中与其他测试的核受体无明显相互作用。在 Ames 试验中，MI-883 无遗传毒性；在大鼠 28 天重复口服毒性研究中，高达 10mg/kg 剂量时未观察到毒性。
3. MI-883 稳定野生型 CAR 但具有独特的 PXR 结合模式：分子动力学模拟显示，MI-883 在 wtCAR-LBD 中的构象与 CITCO 相似，通过一系列疏水、π 介导和极性相互作用稳定结合。在 PXR-LBD 中，MI-883 与 SR12813 的结合模式存在差异，它通过与 W299、Y306 和 F288 的疏水相互作用稳定结合，且与 H407 的直接氢键相互作用较少。此外，MI-883 与 PXR 结合时，H12 和 H3 之间的距离以及 C207 和 A312 之间形成水通道的距离均小于 SR12813，这些结构变化可能与 MI-883 的拮抗作用相关。
4. MI-883 对 CAR 和 PXR 与共激活剂 / 共抑制剂相互作用的影响：MARCoNI 核受体 - 共调节因子相互作用分析表明，MI-883 吸引 NCOA1、NCOA2 和 NCOA3 等共激活剂的方式与 CITCO 相似。在细胞实验中，MI-883 不招募 NCOA1、NCOA2 和 MED1 到 PXR，反而破坏 PXR 与共抑制剂 NCOR2 的相互作用，并阻断激动剂利福平对 NCOA1 的招募。
5. MI-883 对 CAR/PXR 靶基因调控的影响：在分化的 HepaRG、HepaRG KO PXR 或 HepaRG KO CAR 细胞以及原代人肝细胞（PHH）中，MI-883 以 PXR 依赖的方式抑制利福平诱导的和基础的 CYP3A4 mRNA 表达；对 CYP2B6 mRNA 的调控较为复杂，在 HepaRG 和 PHH 中表现出 CAR 激活主导的调控模式。在 3D 原代人肝细胞球状体和 hPXR/hCAR/CYP3A 小鼠肝脏中，MI-883 也呈现出对 CYP3A4 和 CYP2B6 不同的调控效果。此外，MI-883 对胆固醇、胆汁酸合成和脂质调节相关的关键基因也有影响，如抑制 SQLE mRNA 的诱导，下调 SREBF1 mRNA 表达，上调 INSIG1 mRNA 等，但对 CYP7A1 mRNA 的调控机制较为复杂，需要进一步研究。
6. MI-883 选择性降低血浆胆固醇浓度：在人源化 PXR-CAR-CYP3A4/3A7 小鼠的 HFD 和 HCD 模型中，MI-883 治疗后可系统性降低总血浆胆固醇浓度和 LDL 胆固醇水平，同时在部分实验中观察到 HDL 胆固醇浓度下降。在 PXB-mouse 人源化肝脏小鼠中，MI-883 对总胆固醇浓度的影响虽未达到统计学意义，但有降低 LDL 和增加 HDL 胆固醇血浆浓度的趋势。此外，MI-883 对甘油三酯和葡萄糖浓度影响较小，且不影响肝脏和肾脏的组织学、形态学以及肝脏脂肪变性，也未表现出肝毒性和肾毒性。
7. 胆固醇、胆汁酸和脂质组分析：脂质组学和代谢组学分析显示，MI-883 处理后，小鼠肝脏中的游离胆固醇显著降低，而血浆和肝脏中的总胆汁酸浓度未受影响，但粪便中的总胆汁酸含量显著增加，包括 β- 鼠胆酸（BMCA）和鹅去氧胆酸（CDCA）。在脂质类别的分析中，发现 MI-883 处理后，肝脏中含有长链和高度不饱和脂肪酸的甘油三酯（TG 60:12、TG 60:13）显著增加，总溶血磷脂酰胆碱（LPC）水平显著降低。
8. 肝脏样本的 NGS RNA-Seq 分析：对给予 MI-883 的人源化 PXR-CAR-CYP3A4/3A7 小鼠肝脏样本进行 RNA-Seq 分析，发现 MI-883 显著上调了一些参与外源性物质代谢和不饱和脂肪酸、类花生酸脂质代谢的基因和通路，同时显著下调了参与脂肪酸代谢的基因（如 Scd1、Fabp2 和 Srebf1） 。此外，还观察到一些与胆固醇代谢相关的基因表达变化，如 Scarb1、Angptl3 和 Lipc 基因表达下调，ApoC1、Apoc4、Apoa5 和 Apoa1 等载脂蛋白基因也有不同程度的下调。通过 RT-qPCR 分析进一步验证了 RNA-Seq 数据中主要靶基因的表达变化。
9. MI-883 对人肝细胞肥大和增生的影响：在 PXR-CAR-CYP3A4/3A7 小鼠中，MI-883 处理后，抗凋亡基因 murine Gadd45b mRNA 和 Meg3 lncRNA 表达上调。但在 3D 人肝细胞球状体和 PXB 人源化肝脏小鼠中，MI-883 对关键增殖生物标志物 MDM2、PCNA 和 FOXM1 无显著影响，也未观察到肝脏增大、球状体大小或 ATP 产生的变化，表明 MI-883 不会刺激人肝细胞肥大和增生。

研究结论与讨论

本研究成功发现并表征了 MI-883 这一具有双重活性的化合物，它对 CAR 和 PXR 均具有高效的调节能力，且具有良好的理化性质、代谢稳定性、药代动力学特性和安全性。在细胞和动物模型中，MI-883 通过调节胆固醇和胆汁酸代谢相关的关键基因，有效降低了血浆胆固醇浓度，调节了胆汁酸的排泄和肝脏脂质代谢。尽管目前仍存在一些问题，如对 CYP7A1 基因调控的复杂机制以及对肠道微生物群潜在影响尚未明确，但 MI-883 的发现为治疗高胆固醇血症等代谢性疾病提供了新的靶点和潜在药物，也为开发针对多个外源性物质核受体的配体开辟了新的途径，有望推动代谢性疾病治疗领域的发展，为未来的药物研发提供重要的理论依据和实践指导。