复制-标识将表观遗传和代谢途径与复制应激反应联系起来

细胞激活各种途径来对抗DNA复制压力。利用复制标识符（Repli-ID），作者鉴定了423个基因，包括LGE1和ROX1，这些基因将表观遗传和代谢途径与复制应激反应联系起来。

　　

探究 DNA 复制应激反应新机制：Replication-IDentifier 技术的关键作用

莱顿大学医学中心人类遗传学系的 Sophie C. van der Horst、Leonie Kollenstart 等研究人员在Nature Communications杂志上发表了题为 “Replication-IDentifier links epigenetic and metabolic pathways to the replication stress response” 的论文。该研究开发了 Replication-IDentifier（Repli-ID）技术，首次在全基因组范围内鉴定出酿酒酵母 DNA 复制的调控因子，将表观遗传和代谢途径与复制应激反应联系起来，为深入理解细胞应对 DNA 复制扰动的机制提供了关键线索，也为相关疾病的研究和治疗开辟了新方向。

一、研究背景

DNA 复制是细胞生存和基因组稳定性的基础，但它持续面临着内外部多种因素的挑战。例如，DNA 损伤、药物干扰等会导致复制叉停滞或崩溃，进而引发一系列严重后果，包括基因组不稳定和癌症的发生。为应对这一情况，细胞进化出了复制应激反应机制，该机制能稳定复制叉、激活细胞周期检查点并诱导 DNA 损伤反应基因的表达。尽管目前已知一些因素参与这一反应，但涉及的完整蛋白质谱仍不明确。此前的研究方法大多通过细胞存活间接测量复制应激反应，缺乏在应激条件下直接、全基因组范围测量复制叉进展或稳定性的手段，这限制了对相关机制的深入理解。

二、研究材料和方法

（一）实验材料

研究使用了多种酿酒酵母菌株，包括来自酵母敲除（KO）文库的菌株、带有条形码的菌株等，这些菌株被用于构建实验所需的文库和进行各种实验检测。实验中还使用了多种抗体，如抗 Myc、抗 FLAG 等，用于染色质免疫沉淀（ChIP）和蛋白质印迹分析等实验技术。

（二）关键技术路线

Repli-ID 技术是本研究的核心。该技术基于染色质免疫沉淀（ChIP） - 条形码筛选方法 Epi-ID 和经典 ChIP - qPCR 实验改进而来。研究人员利用已有的条形码文库，将条形码整合到酵母菌株的 HO 位点（位于复制起点 ARS404 下游 53bp 处），通过合成遗传阵列（SGA）技术将条形码文库与酵母 KO 文库杂交，构建出包含约 4500 个条形码突变体和约 1100 个条形码野生型对照的 Repli-ID 文库。在实验过程中，对文库中的菌株进行处理，使其同步化在 G1 期，然后释放到含有羟基脲（HU）的培养基中进入 S 期，在特定时间点进行 ChIP 实验，监测 Pol ε 在 ARS404 附近条形码处的结合情况，再通过下一代测序对条形码进行计数，根据条形码的丰度反映 Pol ε 的含量，进而评估复制叉的进展或稳定性。

三、研究结果

（一）Repli-ID 技术的建立与验证

研究人员通过实验确定 ARS404 为晚期启动的复制起点，为克服其在 HU 存在下启动受抑制的问题，过表达不能被 Rad53 磷酸化的 Sld3 和 Dbf4 突变体（sld3 - 38A dbf4 - 4A），成功实现 ARS404 在 S 期的启动。在此基础上，建立了 Repli-ID 文库和实验条件，并通过对已知影响复制叉稳定性的基因 sgs1Δ 突变体的验证，证明了该技术的有效性。对约 1100 个条形码突变体和约 1000 个条形码野生型菌株的研究发现，ARS404 处 Pol ε 水平在两者中相等，且在 S 期释放 40 分钟时结合最强，80 分钟后下降，这两个时间点被选定用于后续的 Repli-ID 筛选。

（二）Repli-ID 鉴定已知和新的复制叉稳定性 / 进展调节因子

进行两次独立的 Repli-ID 筛选后，研究人员获得了高质量的数据集。最终，在 2905 个突变体中确定了结果，共鉴定出 423 个 Pol ε 水平降低的突变体，这些突变体可能存在复制叉稳定性 / 进展受损或 S 期进入减少的问题；128 个 Pol ε 水平升高的突变体，可能是由于复制叉持续停滞；还有部分突变体在特定时间点出现 Pol ε 水平变化，反映出不同的复制叉进展情况。通过与之前发表的 G1 期细胞水平增加的突变体列表对比，发现 Repli-ID 筛选出的突变体中，因 S 期进入缺陷导致 Pol ε 水平降低的比例仅略有增加。此外，Repli-ID 筛选出的突变体在染色质组织、液泡运输和内体运输等 GO Slim 术语中富集，且鉴定出的最强突变体中包含已知在 DNA 复制中起作用的基因，这表明 Repli-ID 技术能够同时在近 4500 个菌株中检测 Pol ε 丰度，识别出已知的复制叉稳定性 / 进展调节因子。

研究还发现了一些此前作用不明的新因子。对随机选择的突变体进行 ChIP - qPCR 验证，结果显示部分突变体（如 tpa1Δ、cse2Δ、rec8Δ、nsr1Δ、fpr4Δ、efg1Δ、pml1Δ、apt1Δ、rox1Δ、lge1Δ）的 Pol ε 水平与阳性对照 pol32Δ 相当，验证了 Repli-ID 的结果。进一步研究发现，部分突变体（如 fpr4Δ 和 apt1Δ）在无 HU 条件下也影响复制叉，而 rec8Δ 则在复制应激条件下特异性影响复制叉。在不同背景下重新构建部分突变体并进行实验，发现 Nsr1、Rox1 和 Lge1 的缺失会导致 Pol ε 水平下降，且这些突变体中晚期启动子 ARS501 未被激活，同时通过斑点稀释试验发现 rox1Δ 和 lge1Δ 对 HU 敏感，nsr1Δ 则不敏感，因此研究人员决定进一步研究 Lge1 和 Rox1 在复制应激反应中的作用。

（三）Lge1 通过促进 H2B 单泛素化影响应激条件下的 DNA 复制

Lge1 是 Bre1 的辅助因子，Bre1 与 E2 结合酶 Rad6 协同作用，使组蛋白 H2B 在赖氨酸 123 处单泛素化（H2Bub）。研究发现，lge1Δ 突变体中 H2B 泛素化受损，通过异位表达 LGE1 可挽救这一现象。对野生型和 lge1Δ 突变体细胞的研究表明，Lge1 缺失导致 ARS607 附近 Pol ε 富集在不同时间点均显著下降，DNA 合成延迟且减少，细胞周期分析显示在 HU 存在下，细胞进入和进展到 S 期受损。在无 HU 条件下，S 期 25 分钟时 Pol ε 富集也显著下降，但 MCM 解旋酶加载正常，Mcm4 进展受损。这些结果表明，Lge1 在未受干扰和应激条件下均调节 DNA 复制，可能通过影响复制起始和 / 或叉稳定性发挥作用。

进一步研究发现，Lge1 促进 Bre1 依赖的 H2B 泛素化，在野生型细胞中，ARS607 附近 H2Bub 水平在不同时间点保持稳定，而 lge1Δ 突变体中 H2Bub 水平显著降低，且 Lge1 和 Bre1 在 H2B 泛素化过程中表现出上位性。此外，在 HU 处理 40 分钟后，Bre1 缺失时 Pol ε 结合水平与 Lge1 缺失时相当，这证实了 H2Bub 缺失与 HU 条件下 Pol ε 丢失相关，表明 Lge1 通过促进 Bre1 依赖的 H2B 泛素化影响复制起始和 / 或叉稳定性。

研究人员还发现，Bre1 招募到停滞的复制叉部分依赖于 Lge1。在野生型细胞中，Bre1 在有 HU 时富集在 ARS607 附近，而在 lge1Δ 突变体中，Bre1 的招募仅部分丧失，但 H2Bub 完全丧失，这表明 Bre1 在没有 Lge1 时功能受损，无法有效泛素化 H2B。同时，Lge1 通过维持 Bre1 依赖的 H2B 单泛素化，促进 Rad53 依赖的检查点激活，影响复制叉的恢复。在 lge1Δ 或 bre1Δ 细胞中，Rad53 激活延迟，细胞对 HU 诱导的复制叉停滞恢复受损，而 Lge1 和 Bre1 共同缺失导致类似的损伤，说明它们在这一过程中起协同作用。

（四）Rox1 不通过影响细胞 dNTP 水平影响 DNA 复制

Rox1 是一种保守的转录抑制因子，调节缺氧基因和核糖核苷酸还原酶（RNR）基因。研究发现，rox1Δ 突变体在 HU 处理后，ARS607 附近 Pol ε 水平在各个时间点均显著下降，通过 Mcm4 - 3xFLAG ChIP - qPCR 实验排除了 MCM 解旋酶复制许可受损的可能性，DNA 拷贝数分析证实 Rox1 在 HU 诱导的应激下调节 DNA 复制。虽然 Rox1 在体外抑制 RNR 基因表达，但在 rox1Δ 突变体中，RNR 基因表达变化并未导致 dNTP 水平显著改变，这表明 Rox1 对复制叉进展的影响不能用 RNR 蛋白表达或 dNTP 水平的改变来解释。

（五）Rox1 通过抑制 Sur2 控制复制应激反应

由于 Rox1 是转录抑制因子，研究人员通过 RNA 测序分析其调控的基因，发现 137 个基因被抑制，89 个基因被诱导。通过抑制子筛选，发现 SUR2、TRX2 和 DOG1 等基因的缺失可挽救 rox1Δ 细胞对 HU 的敏感性，RT - qPCR 验证了这些基因在 rox1Δ 细胞中过表达，且 SUR2 基因缺失对 HU 敏感性的挽救存在背景特异性，表明 Rox1 通过抑制 Sur2 表达控制细胞对 HU 的反应。

（六）Rox1 通过 Sur2 调节神经酰胺水平控制复制应激反应

SUR2 编码鞘氨醇 C4 - 羟化酶，参与鞘脂的合成，神经酰胺可激活 PP2A 磷酸酶，影响 DNA 损伤反应。研究发现，添加细胞可渗透的 C2 神经酰胺会增加 HU 敏感性，且 Sur2 缺失可挽救 rox1Δ 细胞的 HU 敏感性，但在有 C2 神经酰胺存在时则无法挽救，这表明 Rox1 通过调节 Sur2 依赖的神经酰胺水平影响细胞对 HU 诱导的复制应激反应，且该过程与 ROS 无关。

（七）Rox1 通过 Sur2 / 神经酰胺控制调节检查点激活和 S 期进入影响 DNA 复制

神经酰胺参与激活 PP2A 磷酸酶，影响细胞周期和检查点激活。研究表明，Rox1 通过抑制 Sur2 / 神经酰胺依赖的 PP2A 激活，控制 Rad53 诱导的 S 期内检查点。在 HU 处理下，野生型细胞中 Rad53 磷酸化增加，而 rox1Δ 细胞中 Rad53 磷酸化水平降低，添加 C2 神经酰胺会进一步抑制其磷酸化。同时，Rox1 通过调节 Sur2 / 神经酰胺依赖的 G1/S 转换促进 S 期进入，rox1Δ 细胞在 HU 处理下 S 期进入延迟，Sur2 缺失可恢复正常，添加 C2 神经酰胺则会再次延迟。此外，ChIP - qPCR 实验表明，Rox1 通过促进 S 期进入和激活 S 期内检查点，维持复制应激条件下 Pol ε 的正常水平，且这一调节功能依赖于细胞神经酰胺水平，由 Sur2 抑制控制。

四、研究结论与讨论

本研究开发的 Repli-ID 技术可同时在数千个酵母突变体中研究复制叉的稳定性和进展。通过该技术，研究人员鉴定出 423 个促进 Pol ε 在停滞复制叉处结合的已知和新调节因子，并对 Lge1 和 Rox1 这两个调节因子进行深入研究，揭示了表观遗传和代谢途径在应激条件下控制 DNA 复制的机制。Lge1 通过促进 Bre1 依赖的 H2B 泛素化，影响复制叉的起始、稳定性和恢复；Rox1 通过抑制 Sur2 依赖的神经酰胺产生，调节检查点激活和 S 期进入，从而影响 DNA 复制。

然而，研究也存在一定局限性。例如，Repli-ID 技术使用特定的条形码文库和过表达 sld3 - 38A dbf4 - 4A 突变体，可能会影响 Pol ε 水平的检测，且无法完全排除拓扑应激和额外复制应激的影响。此外，虽然发现了 Lge1 和 Rox1 的重要作用，但它们在分子层面的具体机制仍有待进一步研究，如 Lge1 与 Bre1 在复制应激反应中的结构 - 功能关系，以及 Rox1 调节的神经酰胺具体类型和相关代谢途径等。

尽管如此，本研究仍具有重要意义。Repli-ID 技术为研究 DNA 复制相关机制提供了强大的工具，其鉴定出的众多调节因子为后续研究提供了丰富资源。对 Lge1 和 Rox1 的研究揭示了新的调节途径，有助于深入理解细胞应对复制应激的机制。此外，研究结果还为相关疾病的研究提供了线索，如人类同源蛋白 WAC 与 Lge1 功能的相似性，以及 Rox1 与哺乳动物转录因子的潜在联系，可能为探索相关疾病的发病机制和治疗策略提供新方向。