EZH2可作为骨髓瘤诱导的溶解性骨破坏的可行治疗靶点

　　

EZH2 可作为治疗骨髓瘤诱导的溶骨性骨破坏的有效靶点

论文于 2025 年 1 月 31 日在线发表于Nature Communications，DOI: 10.1038/s41467-025-56506-5，论文接收时间为 2025 年 1 月 21 日，投稿时间为 2024 年 4 月 11 日。

多发性骨髓瘤骨病是一种并发症，其特征为溶骨性骨病变、骨形成减少、骨痛以及骨折风险增加。厦门大学医学院癌症研究中心的研究人员发现，深入了解这些潜在机制对于开发有效的治疗方法至关重要。在本研究中，他们揭示了 zeste 同源物 2 增强子（EZH2）在骨髓瘤细胞诱导的骨病变中的作用。研究表明，骨髓瘤相关脂肪细胞产生的细胞因子会激活骨髓瘤细胞中 EZH2 的表达。此外，研究人员还发现 EZH2 与转录因子 AP2α 形成转录抑制复合物。该复合物促进肿瘤抑制基因 EMP1 启动子区域组蛋白 H3 赖氨酸 27 位点的三甲基化（H3K27me3），导致转录沉默。EMP1 沉默会使骨髓瘤细胞增殖增加，并伴随溶骨性细胞因子的分泌，进而导致骨破坏。重要的是，EZH2 抑制剂可有效治疗骨髓瘤诱导的溶骨性病变。因此，靶向 EZH2 代表了一种预防和治疗骨髓瘤骨病的潜在治疗策略。

多发性骨髓瘤是一种起源于骨髓中恶性浆细胞的恶性肿瘤，目前仍无法治愈。溶骨性骨病是骨髓瘤的一个显著特征，超过 80% 的患者会受到影响，并引发如病理性骨折、剧烈骨痛、脊髓压迫和高钙血症等多种并发症。骨破坏的不良后果严重损害了患者的生活质量，导致预后较差。

骨是一种动态组织，通过破骨细胞（负责吸收骨）和成骨细胞（负责形成新骨）的协调作用不断进行重塑。破骨细胞起源于造血单核细胞前体，在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子 κB 受体激活剂配体（RANKL）这两种关键因子的刺激下分化形成。M-CSF 与其受体集落刺激因子 1 受体（c-Fms）相互作用，激活特定的信号通路，促进破骨细胞前体的增殖和存活。RANKL 与破骨细胞前体细胞表面的 RANK 结合，触发活化 T 细胞核因子细胞质 1 蛋白（NFATc1）的激活。这种激活随后会上调参与破骨细胞分化的基因表达，如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、降钙素受体（CALCR）和组织蛋白酶 K（CTSK）。成骨细胞是骨重塑周期中的另一个关键参与者，起源于间充质干细胞（MSCs）。成骨细胞的分化受核心结合因子 α-1/ Runt 相关转录因子 2（RUNX2）和 osterix 的激活调节。这种激活会诱导与成骨细胞分化相关的基因表达，包括骨 γ- 羧基谷氨酸蛋白（BGLAP）、碱性磷酸酶（ALP）和 I 型胶原蛋白 α1（COL1A1）。在包括骨髓瘤以及乳腺癌和肺癌等实体瘤在内的多种恶性肿瘤中，骨重塑过程的平衡常常被打破。骨髓瘤细胞可通过细胞间接触直接作用于成骨细胞和破骨细胞，也可通过释放细胞因子或代谢副产物对它们产生影响。此外，骨髓瘤细胞还可通过影响其他细胞类型间接调节成骨细胞和破骨细胞的分化。

EZH2 是多梳蛋白基团（PcG）基因家族的核心成员，在调节组蛋白 H3 赖氨酸 27 残基的三甲基化（H3K27me3）从而抑制基因转录方面发挥着关键作用。在正常生理条件下，EZH2 在个体发育、干细胞分化、自我更新、细胞周期维持、细胞自噬和凋亡、DNA 损伤修复和衰老以及细胞命运决定等过程中发挥着重要的调节作用。此外，在许多肿瘤中都观察到 EZH2 表达的激活，其在肿瘤发生和肿瘤进展中起重要的调节作用。例如，EZH2 促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭；在肺癌中，EZH2 抑制 E2F 转录因子 1（E2F1）调节的细胞凋亡、侵袭、转移和耐药性；在黑色素瘤中，EZH2 基因敲除小鼠模型的淋巴结和肺转移减少；在胰腺癌模型中，EZH2 的过表达促进上皮 - 间质转化（EMT）和血管生成；在卵巢癌中，EZH2 抑制趋化因子 CXCL9 的表达，从而调节 CD8+ T 细胞向肿瘤的浸润。在骨髓瘤中，EZH2 与患者的不良预后密切相关。此外，EZH2 通过调节 IRF4-Myc 信号轴促进骨髓瘤细胞增殖。厦门大学医学院癌症研究中心研究人员的前期工作还表明，骨髓瘤细胞的整合素受体与骨髓脂肪细胞结合，通过 PI3K（磷脂酰肌醇 3 - 激酶）/Akt 信号通路和核因子 κB（NF-κB）信号通路促进脂肪细胞中 EZH2 的表达。这些重编程的脂肪细胞获得了诱导骨病变的能力。然而，EZH2 是否有助于骨病变的形成仍不清楚。

通过体外、体内和患者样本研究，厦门大学医学院癌症研究中心的研究人员发现 EZH2 在骨髓瘤诱导的骨病中具有独特作用。他们发现骨髓瘤相关脂肪细胞分泌的肿瘤坏死因子 α（TNFα）和白细胞介素 - 6（IL6）可激活骨髓瘤细胞中的 EZH2。转录因子 AP2α 与 EZH2 直接相互作用，形成转录抑制复合物。该复合物促进肿瘤抑制基因 EMP1 启动子区域组蛋白 H3 赖氨酸 27 残基的三甲基化，导致转录沉默。EMP1 的抑制会导致骨髓瘤细胞增殖增加，并上调破骨细胞生成细胞因子，最终促进溶骨性骨病变。有趣的是，在体外和体内模型中，EZH2 抑制剂均显著改善了骨髓瘤诱导的溶骨性骨病变。他们的研究结果不仅揭示了癌症诱导骨破坏的机制，还为患有溶骨性骨病变的肿瘤患者提供了一种潜在的治疗策略，即靶向 EZH2。

研究结果

EZH2 加剧骨髓瘤细胞诱导的骨病变

为了探究 EZH2 是否会影响骨髓瘤细胞诱导的骨病变，厦门大学医学院癌症研究中心的研究人员对比了已发表数据集中（GEO: GSE755）患者骨髓瘤细胞中 EZH2 的表达水平。结果显示，有骨病变患者的骨髓瘤细胞中 EZH2 的表达高于无骨病变患者。此外，他们在 30 例患者中发现，骨髓瘤细胞中 EZH2 的表达与骨病变数量呈显著正相关。X 射线扫描和磁共振成像的代表性图像显示，骨病变数量多的患者（P1）颅骨和脊柱的溶骨性病变比骨病变数量少的患者（P2）更多。骨髓穿刺免疫组化结果进一步表明，P1 患者的 EZH2 和 CD138（骨髓瘤细胞表面标志物）表达高于 P2 患者。这些结果表明 EZH2 与骨髓瘤骨病之间存在关联。

为了确定表达 EZH2 的骨髓瘤细胞在体内溶骨性骨病变中的功能作用，研究人员使用针对人 EZH2 的短发夹 RNA（shRNAs，即 shEZH2）敲低 RPMI8226 骨髓瘤细胞中 EZH2 的表达，并在 MM.1S 骨髓瘤细胞中过表达 EZH2 互补 DNA（EZH2）（补充图 1）。随后，他们将 shEZH2 转染的 RPMI8226 细胞注射到小鼠股骨中，观察到与对照 RPMI8226 细胞（shCtrl）相比，溶骨性病变更少，肿瘤生长更慢。相反，过表达 EZH2 的 MM.1S 细胞比对照 MM.1S（Vec）细胞的股骨病变更多，肿瘤生长更快。为了评估骨髓瘤细胞表达的 EZH2 对体内破骨细胞介导的骨吸收的影响，研究人员对作为骨形成标志物的 I 型前胶原 N 端前肽（PINP）和指示骨吸收的 I 型胶原 C 端肽（CTX-1）的血清水平进行了定量分析。研究结果显示，与 shCtrl 和过表达 EZH2 组相比，shEZH2 和 Vec 组的 PINP 水平升高，CTX-1 水平降低。他们还对携带骨髓瘤的小鼠股骨进行了 TRAP 和甲苯胺蓝染色。通过微计算机断层扫描评估骨体积 / 总体积百分比（BV/TV），通过 TRAP 染色评估破骨细胞侵蚀的骨表面百分比（ES/BS）和被破骨细胞覆盖的骨表面百分比（Oc.S/BS），通过甲苯胺蓝染色评估类骨质表面百分比（OS/BS）和成骨细胞覆盖的骨表面百分比（Ob.S/BS），并通过钙黄绿素染色测量骨形成率。骨组织形态计量学分析表明，与注射低 EZH2 表达骨髓瘤细胞（shEZH2 或 Vec）的小鼠相比，注射高 EZH2 表达骨髓瘤细胞（shCtrl 或过表达 EZH2）的小鼠的 BV/TV 百分比更低，ES/BS、Oc.S/BS 百分比更高，OS/BS、Ob.S/BS 百分比和骨形成率更低。为了进一步验证研究结果，研究人员使用了肝内注射患者来源的 CD138 + 原发性骨髓瘤细胞的人源化小鼠模型。此处使用的原发性骨髓瘤细胞与图 1 中所示的 P1 和 P2 一致。他们从小鼠中提取血清并进行 ELISA 分析，以确定作为骨髓瘤负荷指标的人 λ 链浓度。结果显示，注射高 EZH2 表达原发性骨髓瘤细胞（P1）的小鼠血清中人 λ 链水平高于注射低 EZH2 表达原发性骨髓瘤细胞（P2）的小鼠。在小鼠安乐死后，研究人员使用抗 CD138 抗体包被的磁珠从 PDX 小鼠的骨髓中分离出骨髓瘤细胞。P1 组骨髓瘤细胞中 EZH2 的表达仍然高于 P2 组。此外，骨组织形态计量学分析表明，与低 EZH2 表达（P2）的细胞相比，P1 细胞导致更多的股骨病变、更低的骨 BV/TV、更高的 ES/BS% 和更低的 OS/BS%。PDX 小鼠多种组织的免疫组化分析还指出，在小鼠的骨髓和脾脏中发现了骨髓瘤细胞，而在肝脏中较少。这些研究结果揭示了骨髓瘤细胞中 EZH2 表达在促进溶骨性骨病变发展和肿瘤进展中的关键作用，这在患者和骨髓瘤小鼠模型中均得到了验证。

研究人员还特别关注另外两个问题：第一，除了骨髓瘤细胞外，EZH2 的表达是否在骨髓微环境的其他基质细胞中也被激活；第二，骨髓瘤细胞中 EZH2 表达的上调是否与骨髓基质细胞有关。基于 GEO 数据库的数据分析，研究人员检测了从正常骨髓微环境或骨髓瘤微环境中分离的几种基质细胞中 EZH2 的表达。结果表明，骨髓瘤微环境的基质细胞（包括成纤维细胞、巨噬细胞和间充质干细胞）中 EZH2 的表达没有显著差异。然而，脂肪细胞中 EZH2 的表达被激活。他们之前的研究表明，骨髓瘤细胞激活骨髓脂肪细胞中的 EZH2，导致脂肪细胞分泌的脂肪因子发生改变，最终导致骨损伤，并且在这个过程中 TNFα 和 IL6 的表达被激活。用骨髓瘤相关脂肪细胞或正常脂肪细胞的条件培养基处理骨髓瘤细胞。结果表明，与正常脂肪细胞相比，骨髓瘤相关脂肪细胞的 NF-κB 通路激活和 EZH2 表达上调更为显著。此外，抑制 NF-κB 可以抑制 EZH2 的上调。进一步的证据表明，TNFα 和 IL6 可以激活 EZH2 的表达。同样，针对 TNFα 或 IL6 的中和抗体也可以部分逆转 NF-κB 通路的激活和 EZH2 的上调。类似地，NF-κB 通路抑制剂也可以阻断 NF-κB 通路的激活并降低 EZH2 的表达。这些研究结果表明，骨髓瘤细胞和脂肪细胞之间存在相互作用，导致两种细胞类型中 EZH2 基因表达的激活。

EZH2 通过骨髓瘤细胞中的溶骨性细胞因子增强 RANKL 诱导的破骨细胞生成并抑制成骨细胞生成

骨重塑的维持依赖于破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞促进的骨形成之间的微妙平衡。为了研究 EZH2 在维持这一平衡中的潜在调节作用，厦门大学医学院癌症研究中心的研究人员首先评估了其对破骨细胞分化的影响。在 RANKL 刺激的情况下，破骨细胞前体（preOCs）与高 EZH2 表达的骨髓瘤细胞（shCtrl 或过表达 EZH2）共培养，相较于与低 EZH2 表达的骨髓瘤细胞（shEZH2 或 Vec）共培养，显著增加了抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核（TRAP+）细胞的生成、TRAP 5b 的分泌以及破骨细胞分化标志物的表达。这些观察结果突出了 EZH2 在促进骨髓瘤细胞破骨细胞生成中的关键作用。为了进一步探究 EZH2 对成骨细胞生成的影响，研究人员使用成骨细胞祖细胞（MSCs）在成骨细胞分化培养基中与骨髓瘤细胞进行共培养实验，并将在相同培养基中单独培养的 MSCs 作为阳性对照。值得注意的是，与高 EZH2 表达（过表达 EZH2 或 shCtrl）的骨髓瘤细胞系共培养相比，与低 EZH2 表达（Vec 或 shEZH2）的骨髓瘤细胞系共培养的 MSCs 表现出更强的成骨细胞成熟度、更高的碱性磷酸酶（ALP）活性以及更高的成骨细胞分化相关基因表达。这些研究结果表明，骨髓瘤细胞中的 EZH2 起到抑制成骨细胞生成的作用。

接下来，研究人员探究了 EZH2 调节骨细胞分化的机制。骨髓瘤细胞诱导骨损伤的主要机制之一是通过分泌溶骨性细胞因子，增强破骨细胞分化并抑制成骨细胞分化。研究人员使用已发表的 RNA 测序数据集（GSE103567）来检测用或未用 EZH2 抑制剂 GSK343 处理的骨髓瘤细胞中细胞因子的表达谱。根据两组之间倍数变化大于 2 的标准，他们鉴定出四个下调基因（CCL5、IL16、CSF1 和 DKK1）。RNA 测序结果显示，在骨髓瘤细胞系中敲低 EZH2 的表达也得到了类似的结果。定量 PCR 分析证实，与对照细胞（shCtrl）相比，EZH2 敲低细胞（shEZH2）中 CCL5（C-C 基序趋化因子配体 5）、IL16（白细胞介素 16）、CSF1（集落刺激因子 1）和 DKK1（Dickkopf 相关蛋白 1）的表达下调。此外，与对照细胞（Vec）相比，这四种细胞因子在 EZH2 过表达细胞（过表达 EZH2）中的表达显著升高。值得一提的是，RNA 测序结果表明，在 RPMI8226 细胞中敲低 EZH2 的表达抑制了 CCL5、DKK1 和 CSF1 的表达，但 IL16 表达的变化不显著，研究人员认为这种差异可能主要归因于 IL16 的信号值较低或有限样本量引入的潜在误差。ELISA 结果也表明 EZH2 增强了这四种细胞因子的表达。此外，在图 1b 中，从 30 例新诊断患者的骨髓穿刺物中分离出原发性骨髓瘤细胞。相关性分析显示，在这些患者中，EZH2 的表达与这四种细胞因子的表达呈显著正相关。先前的研究表明，CCL5、IL16 和 CSF1 促进破骨细胞分化，而 DKK1 抑制成骨细胞分化。在与 EZH2 过表达的骨髓瘤细胞（过表达 EZH2）共培养的 preOCs 中添加针对 CCL5、IL16 或 CSF1 的抗体，会减少 TRAP + 细胞的数量。同样，使用针对 CCL5 或 DKK1 的抗体可以部分恢复 EZH2 过表达的骨髓瘤细胞（过表达 EZH2）对成骨细胞分化的抑制作用。类似地，在与 EZH2 敲低的骨髓瘤细胞（shEZH2）共培养的 preOCs 中添加 CCL5、IL16 或 CSF1 重组蛋白，会增加 TRAP + 细胞的数量，并且 CCL5 或 DKK1 重组蛋白会增强 EZH2 敲低的骨髓瘤细胞（shEZH2）对成骨细胞分化的抑制作用。这些实验表明，这些细胞因子对成骨细胞和破骨细胞的功能具有生物学影响。因此，骨髓瘤细胞中的 EZH2 通过调节这些细胞因子的表达来调控破骨细胞和成骨细胞的分化。

EZH2 通过上调启动子组蛋白甲基化水平抑制骨髓瘤细胞中 EMP1 的表达

研究人员的下一个目标是阐明 EZH2 促进骨髓瘤细胞增殖和这些细胞因子表达的机制。有报道指出，EZH2 可以抑制许多肿瘤抑制基因的转录。为了鉴定在骨髓瘤细胞中受 EZH2 调控的特定肿瘤抑制基因，厦门大学医学院癌症研究中心的研究人员对比了已发表数据集中（GEO: GSE109673 和 GSE155135）用或未用 EZH2 抑制剂处理的骨髓瘤细胞中几种经典肿瘤抑制基因的表达水平。结果显示，在骨髓瘤细胞中抑制 EZH2 后，EMP1（上皮膜蛋白 1）基因显著激活。EMP1 属于外周髓鞘蛋白 22kDa（PMP22）基因家族，在多种癌症中被广泛认为是一种肿瘤抑制基因，它可以抑制细胞生长和转移、诱导细胞凋亡并阻止血管生成，但在骨髓瘤中的作用和调控机制仍不清楚。同样，通过分析已发表的 GEO 数据集（GEO: GSE2658 和 GSE5900），研究人员发现与正常浆细胞相比，骨髓瘤细胞中 EMP1 的表达要低得多。此外，他们发现骨髓瘤细胞中 EZH2 和 EMP1 的表达呈显著负相关。蛋白质免疫印迹分析表明，与正常浆细胞相比，原发性骨髓瘤细胞中 EZH2 的表达上调，而 EMP1 的表达受到抑制。在骨髓瘤细胞系中，敲低 EZH2 会激活 EMP1 的表达，反之，过表达 EZH2 会抑制 EMP1 的表达。EZH2 和 SUZ12 是多梳抑制复合物 2（PRC2，一种转录抑制因子）的核心亚基。PRC2 唯一已知的组蛋白甲基转移酶活性靶向调节组蛋白 H3 赖氨酸 27 的三甲基化。为了证明这种甲基化