探讨BCL2在多发性骨髓瘤venetoclax耐药中的调控和上游信号转导：治疗干预的潜在途径

　　

探索多发性骨髓瘤中维奈托克耐药机制及治疗新策略 —— 梅奥诊所研究成果解读

梅奥诊所（Mayo Clinic）的研究人员 Rodrigo Fonseca、Yuan Xiao Zhu 等在《Blood Cancer Journal》期刊上发表了题为 “Exploring BCL2 regulation and upstream signaling transduction in venetoclax resistance in multiple myeloma: potential avenues for therapeutic intervention” 的论文。该研究聚焦于多发性骨髓瘤（MM）中维奈托克（VTX）的耐药机制，为开发克服耐药的新型治疗策略提供了关键依据，对改善 MM 患者的治疗效果具有重要意义。

一、研究背景

细胞凋亡逃避是癌症的基本特征之一，BCL - 2 家族蛋白在调节细胞凋亡的内在（线粒体）途径中起着关键作用。抗凋亡蛋白（如 BCL - 2、MCL - 1 和 BCL - XL）可通过隔离 BH3 - only 蛋白（如 BIM 和 PUMA）和效应促凋亡蛋白（如 BAX 和 BAK）来阻止细胞凋亡。BH3 模拟药物可与抗凋亡蛋白结合，诱导细胞凋亡。维奈托克作为一种 BH3 模拟药物，是 BCL - 2 的拮抗剂，已获批用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）和急性髓系白血病（AML），并在 MM 的临床试验中展现出一定疗效，尤其对具有淋巴样特征的疾病亚群，如携带 t (11;14) 易位的患者。然而，MM 患者对维奈托克产生获得性耐药成为临床治疗的一大挑战，因此，深入了解其耐药机制并开发应对策略迫在眉睫。

二、研究材料与方法

（一）细胞与试剂

研究使用了多种人类骨髓瘤细胞系（HMCLs），其详细特征在补充材料中列出。细胞系通过 CNV 分析进行鉴定，并在含有 5% 胎牛血清和抗生素的 RPMI - 1640 培养基中培养。原发性人 MM 细胞从梅奥诊所采集的骨髓穿刺物中获取，通过免疫磁珠选择分离 CD138 + 细胞。同时，研究还使用了多种抗体和化合物用于实验，具体信息见表 S1。

（二）建立维奈托克耐药细胞系

通过对维奈托克敏感的 KMS12PE、OCIMY7、SKMM2 和 OCIMY5 细胞系进行长期维奈托克暴露，建立了 4 种维奈托克耐药 HMCLs。初始维奈托克浓度设定为各细胞系的半最大抑制浓度（IC50），细胞在该浓度下培养至生长速率恢复正常后，逐渐提高药物浓度。通过指纹验证和细胞活力测定（评估 IC50 值）确认耐药细胞系的建立。

（三）蛋白质调节和半衰期评估的时间序列实验

为评估 MCL - 1 的调节，细胞在特定时间内暴露于选定化合物（A - 485、GNE - 781、WP - 1130、冈田酸，OA），处理后收获细胞并储存于 - 80°C。蛋白质半衰期测定时，细胞在各时间点用 25μg/ml 环己酰亚胺孵育；评估处理后的半衰期时，细胞先经感兴趣的化合物预处理，再用环己酰亚胺处理，且在环己酰亚胺处理期间该化合物保持存在，实验重复两次。

（四）免疫印迹和共免疫沉淀分析

免疫印迹按照制造商的方案进行，将 30μg 蛋白质进行 SDS - PAGE，分离后的蛋白质转移到 PVDF 膜上，封闭后用一抗孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育以检测信号，通过增强化学发光（ECL）方法可视化蛋白质条带。共免疫沉淀使用 Takara 的 Co - IP 试剂盒按照说明书进行。

（五）细胞活力测定

使用 3 - (4,5 - 二甲基噻唑) - 2,5 - 二苯基四氮唑溴盐（MTT）染料吸收测定法或 CellTiter - Glo 活力测定法评估细胞活力和生长，每个实验条件重复三次或四次，且至少重复两次。

（六）DNA 和 RNA 提取

使用 RNeasy 或 AllPrep DNA/RNA Kit 从 HMCLs 和 MM 患者的 CD138 + 骨髓细胞中提取总 RNA 和基因组 DNA。

（七）mRNA 测序（mRNA - seq）和数据分析

mRNA 测序采用捕获法，每个样本产生约 2000 万条读数。差异表达分析包括读数计数归一化、基于模型的 P 值估计和错误发现率（FDR）估计。使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）对差异表达基因进行富集分析，同时，mRNA - seq 数据通过梅奥诊所 RNA - S 管道进行处理，使用 TophAT V2.0.12 将读数与人类 hg19 基因组比对，通过 featureCounts v.1.4.4 量化基因计数，使用 EdgeR v2.6.2 识别差异表达基因（FDR≤0.05），通过 Ingenuity pathway analysis（IPA）评估富集途径。

（八）全外显子测序（WES）

WES 由 Novogene 进行，数据由梅奥诊所的生物信息学核心进行分析。双端读数经 Fastp 进行接头修剪和低质量碱基去除，然后与人类基因组参考（HG38）比对，使用 GATK 进行重复读数标记和碱基重校准，通过 mutect2 从配对样本中检测体细胞突变，并使用 mutect2 模块 FilterMutectCalls 进行过滤，突变由 SnpEff 注释，VCF 文件通过 vcf2maf 转换为 MAF 格式，并用 maftools 查看。

（九）定量蛋白质组学分析

对维奈托克敏感和耐药细胞系进行定量蛋白质组学分析，蛋白质在 9M 尿素和 50mM 碳酸氢三乙铵裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中提取，经还原、烷基化后，用 Trypsin/Lys - C 酶混合物消化，肽段用 TMTpro 试剂标记，然后通过碱性 pH 反相分级在 UltiMate 3000 HPLC 系统上分离成 24 个组分，使用 Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪连接 Vanquish Neo 液相色谱系统进行 LC - MS/MS 分析，蛋白质鉴定和定量使用 Proteome Discoverer 软件版本 3.0 进行。

（十）统计分析

采用多种方法和软件工具进行数据分析。细胞活力测定数据相对于未处理对照进行归一化，使用非线性回归分析（GraphPad Prism，Version 9.5.1）计算 IC50。蛋白质半衰期通过单相指数衰减非线性回归分析确定。使用 SynergyFinder 软件进行药物协同分析，Student’s t 检验和 ANOVA 分析用于确定实验条件之间的统计学差异，Western Blot 条带密度使用 iBright Analysis Software 计算，总蛋白质含量通过管家基因标准化或总蛋白质标准化协议进行标准化，使用 Pearson 相关系数检验两个连续变量之间的线性关系，使用 BlueSky Statistics 进行非线性回归分析研究蛋白质表达与 RNA - seq 数据之间的关系。

三、研究结果

（一）MM 细胞对维奈托克获得性耐药时 BCL2 家族成员表达变化但无 BCL2 突变

通过在维奈托克存在的情况下培养相应的敏感 HMCLs，建立了 4 种对维奈托克耐药的 HMCLs，且部分细胞系在撤药后仍保持耐药性。对 4 对同基因敏感 / 耐药 HMCLs 和 3 例 MM 患者治疗前后的样本进行转录组分析发现，维奈托克耐药与 BCL2 家族蛋白失调相关，常见变化包括 BCL2L1（BCL - XL）上调和 BCL2L11（BIM）、BBC3（PUMA）、BIK 和 BMF 下调。Western blot 分析显示，大多数耐药 HMCLs 中抗凋亡蛋白（MCL - 1 和 BCL - XL）上调，BH3 - only 成员（如 BIM、PUMA 等）下调，效应促凋亡蛋白（BAX 和 BAK）也下调。BCL - 2 表达在部分耐药细胞系中先下调后上调。全外显子测序未检测到 BCL2 或其他 BCL2 家族成员的获得性突变。蛋白质组学分析进一步验证了 MCL - 1、BCL - XL、BCL - 2 和 BIM 的表达变化，且发现转录组和蛋白质组数据的相关性因蛋白质而异。

（二）过表达 BIM 和联合使用选择性 MCL - 1 和 / 或 BCLXL 抑制剂可克服对维奈托克的获得性耐药

BIM 表达缺失与 HMCLs 对维奈托克的获得性耐药相关，将外源性 BIM 导入耐药细胞系可恢复其对维奈托克的敏感性，并增强对选择性 MCL - 1 抑制剂 S68345 的敏感性。维奈托克与 S68345 联合使用在多个耐药 HMCLs 和原发性 MM 细胞中诱导出强大的协同抗骨髓瘤活性；与靶向 BCL - XL 的 A1155463 联合使用，在部分细胞系中也产生协同细胞毒性；同时使用维奈托克、MCL - 1 抑制剂和 BCL - XL 抑制剂时，抗 MM 活性最强。

（三）靶向 MCL - 1 的翻译后修饰对提高维奈托克敏感性作用有限

耐药细胞系中 MCL - 1 蛋白上调与转录表达无关，提示翻译后机制可能参与其中。研究发现 MCL - 1 在 HMCLs 中的半衰期显著长于文献报道及其他癌细胞系，且其蛋白丰度在不同细胞系中与半衰期或转录相关。使用 p300/CBP 抑制剂（A - 485、GNE - 781）和 USP9X 抑制剂（WP - 1130）处理后，MCL - 1 在 HMCLs 中上调，与维奈托克联合使用时协同活性较低。PP2A 磷酸酶抑制剂 OA 可缩短 MCL - 1 半衰期，与维奈托克联合使用在部分细胞系中有中等协同活性。

（四）靶向 PI3K 和 RTK 通过调节 BCL2 家族蛋白增强维奈托克活性

对同基因敏感和耐药 HMCLs 的差异表达基因进行通路分析，发现 PI3K/AKT 和 MAPK 通路富集。抑制 AKT 可增加所有耐药 HMCLs 对维奈托克的敏感性，而抑制 MAPK 作用不明显。通过对耐药样本中上调基因的分析，发现多种细胞因子、生长因子及其受体上调。联合使用维奈托克和靶向 IGF1、FGF 和 EGF 受体相关酪氨酸激酶（RTKs）的抑制剂，可使过表达这些生长因子的耐药细胞系对维奈托克敏感，且这种敏感性增强与 BCL - 2 家族蛋白的变化有关。

（五）抑制 Aurora 激酶 A（AURKA）和 ETC1 可增加耐药 HMCLs 对维奈托克的敏感性

AURKA 在耐药细胞系和复发患者样本中表达升高，维奈托克与 AURKA 抑制剂 MK - 5108 联合使用在部分耐药 HMCLs 中产生协同活性。呼吸电子传递链（ETC）活性可预测 MM 对维奈托克的反应，耐药样本中部分 ETC 基因表达改变，但维奈托克与线粒体复合物 I 抑制剂 IACS - 010759 联合使用仅轻微增强维奈托克的活性。

四、研究结论与讨论

该研究全面探讨了 MM 中维奈托克内在和获得性耐药的分子机制，揭示了 BCL - 2 家族蛋白与多种信号通路的复杂相互作用。研究确认了 BIM 下调、MCL - 1 和 BCL - XL 上调是耐药样本中最常见的变化，重新引入 BIM 可部分恢复耐药细胞对维奈托克的敏感性，并增强对 MCL - 1 抑制剂的反应，提示靶向 BIM 或其调节途径可能是一种有前景的治疗方法。同时，其他促凋亡蛋白（如 BIK、NOXA 和 PUMA）的下调也可能有助于耐药，进一步研究这些蛋白的作用机制具有重要意义。

虽然维奈托克与 BCL - XL 抑制剂联合使用在大多数情况下协同活性较低，但与 MCL - 1 抑制剂或 MCL - 1 和 BCL - XL 抑制剂联合使用时，可更有效地克服耐药，表明 MCL - 1 在维奈托克耐药中起关键作用。然而，MCL - 1 水平与对其抑制剂的反应之间缺乏明确相关性，可能是由于抗凋亡蛋白的功能冗余。

研究还发现，维奈托克与传统抗骨髓瘤疗法联合使用在耐药细胞系中协同活性不佳，可能是因为获得性耐药改变了细胞的凋亡依赖性，降低了在未接触维奈托克时有效的联合疗法的疗效，且维奈托克耐药可能导致对其他标准抗骨髓瘤药物的交叉耐药。

此外，研究探索了 MCL - 1 在耐药细胞系中上调与翻译后修饰的关系，发现 p300、USP9X 和 PP2A 抑制剂对 MCL - 1 稳定性和维奈托克敏感性的影响因细胞环境而异，表明 MM 中 MCL - 1 的稳定性可能不依赖于泛素调节。同时，BCL - XL 和 MCL - 1 的过表达可能导致更广泛的化疗耐药表型，影响维奈托克与传统药物联合治疗的效果。

通过对 PI3K/AKT、MAPK 和 RTK 等通路的研究，发现抑制 AKT 和特定 RTKs 可增强耐药细胞对维奈托克的敏感性，与 BCL - 2 家族蛋白的变化相关；AURKA 表达升高与维奈托克耐药有关，抑制 AURKA 可增加敏感性；虽然线粒体复合物 I 抑制对增强维奈托克活性效果有限，但靶向与 BCL - XL 和 MCL - 1 表达增加相关的代谢脆弱性可能是一种潜在策略。

与其他血液系统恶性肿瘤相比，MM 中维奈托克耐药机制既有共性（如抗凋亡蛋白上调、促凋亡蛋白下调和生存信号通路激活），也有差异（如 MM 中未检测到 BCL - 2 突变），体现了不同疾病耐药机制的复杂性。

该研究为理解维奈托克耐药机制提供了深入见解，确认了关键蛋白和相关通路，为进一步研究维奈托克与 MCL - 1 和 BCL - XL 抑制剂或 PI3K 和 RTK 抑制剂联合治疗 MM 奠定了基础。强调了深入评估原发性患者耐药谱的重要性，有助于开发预测生物标志物和优化治疗策略。未来研究可通过扩展共免疫沉淀实验、BH3 分析和基因敲除研究等，进一步阐明耐药机制，为 MM 患者提供更有效的治疗方案。