实验室培养的人类胚胎的下一步是什么？

今年国际干细胞协会发布了新指导方针，研究人员现在被允许在实验室培育人类胚胎超过14天。

　　

这是阿里·布里万卢实验室一系列实验的第13天，他面临着一项痛苦的任务。他的发育生物学家团队解冻了几十个人类胚胎，将它们放入单独的培养皿中，观察它们在发育的最初阶段成长——世界上只有少数研究人员见过这种情况。但他知道这一切必须结束。

这些胚胎很快就会违反14天规则，14天规则是一个国际共识，即人类胚胎应在实验室中培养和生长，直到受精后14天。第14天大致是原始条纹出现的时候，这一结构标志着胚胎形成身体轴，并开始区分头和尾，左和右。

“这是我一生中不得不做出的最艰难的决定之一，但是时候停止这个实验了，”布里万卢回忆起2015年在纽约洛克菲勒大学(Rockefeller University)他的实验室里进行的研究。第13天，研究小组将培养皿底部的胚胎剥离并冷冻，从而限制了进一步的发育。“我们不知道在那之后会发生什么，”他说。

现在，布里万卢和其他发育生物学家有机会找出答案。

今年5月，国际干细胞研究协会(ISSCR)发布了新的指导方针，放宽了14天的规定，消除了硬性障碍。虽然世界上只有几个实验室完善了培养人类胚胎所需的技术，直到第14天，但科学正在迅速发展。放宽的规定允许实验室小组在其合法的国家向监管机构申请超过14天的研究许可。这些研究可以揭示受精后大约一周，胚胎正常地植入子宫后，人类的发育过程中发生了什么。然后，大约在第14天到第22天之间，它会经历一个被称为“原肠形成”的阶段，这时身体的主要模式出现了，器官生成的基础也奠定了。

在这些后期阶段打开一扇窗，科学家们就能更好地理解近三分之一的怀孕损失和许多先天性出生缺陷，这些缺陷被认为是在发育的这些阶段发生的。此外，这些阶段为细胞如何分化为组织和器官提供了线索，这可能会促进再生医学的发展。

大多数研究人员预计，布里万卢的团队和少数其他人将立即推动在实验室中更长时间地培育人类胚胎的技术边界。少数能做到这一点的团体正处于激烈的竞争中。在其他地方，要想推进这类研究，就必须修改法律例如，昆明理工大学胚胎学家Tianqing Li说，中国的一些研究人员正在讨论是否要改变他们的国家政策，以应对新的规则。 

一些研究人员并不期待14天后会出现大量新的研究——他们也不相信这些实验是合理的。伦敦弗朗西斯克里克研究所(Francis Crick Institute)的发育生物学家娜奥米·莫里斯表示:“我对利用人类胚胎作为研究系统持谨慎态度。”

作为一种跨越边界的方法，研究人员在过去五年中开发了一系列人类胚胎模型，其中大多数是由干细胞混合物形成的。这些模型模拟了早期发育的多个但短暂的阶段，而且可以在不使用体外受精(IVF)治疗的人捐献的稀少且充满道德风险的人类胚胎的情况下制作。到目前为止，14天规则并不适用于这些胚胎模型。但是，随着它们变得越来越复杂，有可能形成可识别的结构，甚至器官，它们进入了自己的道德灰色地带。

无论是使用模型还是实物，科学家们表示，他们有很多东西要学习。“胚胎是伟大的大师，”维也纳奥地利科学院分子生物技术研究所的干细胞生物学家和胚胎学家尼古拉斯·里夫隆说：“它们是教会我们一切关于我们如何形成和如何失败的结构。”

14天规则最初是在1979年提出的，当时试管受精技术出现了，人类胚胎第一次在体外存在——尽管当时它们能存活的最长时间只有几天。到2006年，当ISSCR发布了第一套人类胚胎干细胞(ES细胞)的指导方针时，14天规则在研究界牢固确立。

在实验室培养的人类胚胎的限制被干细胞体所打破。

该指南已被世界各地的研究人员和资助者广泛采用。在包括德国和奥地利在内的几个国家，对人类胚胎进行任何研究都是非法的，而其他许多国家，如英国、中国、日本、澳大利亚和加拿大，都通过法律规定了14天的限制。在包括美国和以色列在内的一些地方，虽然有指导方针，但没有法律禁止或限制人类胚胎研究，尽管在美国，这项研究不能得到联邦政府的资助。

ISSCR指南的上一次更新是在2016年发布的，就在两个研究小组发表突破之前。

英国剑桥大学的Magdalena Zernicka-Goetz实验室从2013年开始探索培养七天以上的人类胚胎。这个小组想要了解囊胚期或“细胞球”期之后会发生什么。她的团队精心设计了激素和生长因子的正确配方，2016年，她的团队和布里万卢的团队报告称，他们已经培育出了人类胚胎，直到第12-13天。

Zernicka-Goetz说:“我们正在进行的发现，比如人类将我们未来的头放在哪里，是非常重要的。”她现在在英国的实验室和帕萨迪纳加州理工学院的一个实验室工作。“我对发育的第二、第三和第四周很感兴趣，这是我们用超声波无法看到的，但它开始了主要器官祖细胞的发育。”

其中一个问题与胚胎细胞在成长过程中如何表达基因有关。在迄今为止规模最大的人类胚胎研究中，Zernicka-Goetz的研究小组分析了从胚胎正常植入子宫(第5天)到第11天准备排卵的16个胚胎在实验室中发育的4820个单细胞。单细胞RNA测序揭示了在胚胎细胞从全能性向多能性(一种更分化的状态)转变时，哪些基因关闭了，哪些基因打开了。

虽然这些发育信号在老鼠身上已经被发现，但这项研究是首次揭示支持人类发育的分子之一。

           

受精10天后实验室培养的人类胚胎，紫色显示将成为胎儿的细胞。图片来源:剑桥大学Zernicka-Goetz实验室

 

在其他只能用人工培养的人类胚胎进行的实验中，布里万卢和Zernicka-Goetz以及他们的团队都在追踪带有非整倍体细胞的人类胚胎的命运。这些细胞具有异常数量的染色体，这种情况被认为是导致多达一半的早孕流产的原因。

体外受精诊所通常只检测少量胚胎细胞，以分析其遗传健康状况。但实验表明，这可能是误导。Zernicka-Goetz的研究小组发现，被诊断出某些类型的非整倍体的胚胎在实验室中继续正常发育。布里万卢的研究小组分析了人类胚胎从第3天到第14天的基因表达，发现染色体数量异常的细胞被消除了——可能是由于发育成支持组织，或者是由于细胞死亡而被剔除。这两项研究都表明，体外受精胚胎通常进行的非整倍体测试可能会导致许多胚胎被错误地认为“不健康”。

布里万卢说，对人类胚胎的研究对这些见解至关重要。他说:“我们只能通过观察事态发展来了解这一点。”他正在计划一些实验——其中一些可能会持续到第14天——试图找出含有某些非整倍体细胞的胚胎是如何调整的。

超过两周

研究动物胚胎的人员已经将它们培养超过了14天的发育时间，这可能为人类胚胎培养的类似进展铺平道路。今年3月，以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所(Weizmann Institute of Science)的雅各布·汉纳团队将小鼠胚胎在实验室的培养时间增加了一倍，从第5.5天增至第11天(大致相当于人类的第13天至30天)。尽管其他研究人员称这一过程过于繁琐，但胚胎在器官发育过程中进展顺利。

布里万卢和Zernicka-Goetz都计划进一步推动人类胚胎培养的极限，在人类身上做汉娜的团队在小鼠身上做的事情。布里万卢想要解开将干细胞转化为第一批脑细胞的遗传程序，也想要揭示四室跳动心脏的分子指令。这两种情况都发生在第14天，解开它们可能是理解神经发育障碍和常见的先天性心脏缺陷的关键。

布里万卢和其他人说，在未来，研究人员将在技术上能够在实验室里观察人类胚胎植入子宫组织。他的团队正在向他所在大学的管理委员会申请将他们对人类胚胎的研究延长到第21天。在这额外的一周内，整个身体的计划已经确定，包括将成为脊髓、大脑、骨骼、心脏、血液、肌肉和面部的结构。他说:“我不知道我们是否能让人类胚胎超过14天。但一旦我们到达那里，我们应该非常小心地前进。”

模型的胚胎

研究人员已经有了一些方法来观察哺乳动物的原肠生成过程，不是通过使用真正的胚胎，而是通过用干细胞的3D混合物构建模型。

在过去的五年里，研究人员在实验室里制作了各种各样的胚胎模型，可以用来观察第14天以后的阶段。在大多数情况下，这些胚胎模型不受14天规则或任何特别审查的约束。

           

这些模拟胚泡阶段的胚胎模型是由皮肤细胞重新编程而成的。信贷:莫纳什大学

 

2017年，密歇根大学安娜堡分校(University of Michigan In Ann Arbor)的生物医学工程师傅建平(Jianping Fu)和他的团队简单地将胚胎干细胞放入3D培养中，制造了第一个人类胚胎模型。在3D培养中，胚胎细胞自组织形成羊膜囊和原始条纹的最初迹象。傅说，这一发现在该领域引发了极大的兴奋。“这种可能性存在于人类胚胎干细胞中——这太神奇了。”

像傅建平的模型不断增殖，现在可以模拟小鼠和人类最早胚胎阶段的部分——植入、原肠形成，以及大脑、脊髓和心脏发育的初始阶段。例如，傅和其他人已经创造出了人类神经样体，它模拟了脊髓和大脑前体的形成，傅说这将有助于研究人员培养功能性神经元，有朝一日可以将这些神经元植入患者体内。这些细胞的混合物通常在外观和行为上都与处于同一阶段的胚胎相似，但它们是否再现了正常发育过程中的分子和细胞活动仍然是一个巨大的知识鸿沟。

傅和其他人承认，随着人类胚胎模型形成更复杂的结构，并在发育时间表上推进，它们提出了新的伦理问题。例如，它们的神经元会开始兴奋，心脏细胞会开始跳动。或者他们可以获得超越目前所模仿的有限阶段的发展潜力。大多数模型缺乏形成完整胚胎所需的完整生命支持组织，但在过去几年里，一些实验室已经构建了囊胚阶段的小鼠和人类模型，称为“囊胚”。这些含有支持组织的前体，理论上可以形成整个有机体。

 

实验室培养的结构模仿了人类胚胎的早期阶段

 

ISSCR关注这一领域，它的指导方针指出，包含这些支持组织的模型必须受到特别监督，并在满足科学目标所需的最短时间内生长。Francis Crick研究所的干细胞生物学家、ISSCR指导委员会主席Robin Lovell-Badge说，随着它们的发展，这些模型将需要伦理上的重新考虑。“显然，这个领域必须受到关注。”

随着对真实胚胎和模型胚胎的研究不断深入，科学家们渴望知道这两个胚胎到底有多相似。研究人员希望在真正的胚胎中研究超过14天，主要原因是要找出模型在分子细节上的差异，以及它们的细胞如何表现。“我们可以从一个模型中学到很多东西，”德国德累斯顿马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所的发育生物学家杰西·维恩弗利特说。“但重要的是要知道哪里出了问题。”

2020年，莫里斯及其同事对小鼠胚胎和小鼠胃泌体进行了并排基因表达比较，发现建立人体计划的信号定时波有惊人的相似之处。她说，这种精确的基准也应该用于人类类胃体，这将需要培养人类胚胎直到第21天左右。Rivron为人类发展的每个阶段设想了分子图谱。

一旦制定了足够的基准，研究人员就可以减少使用人类胚胎的数量，只有在有充分理由时才会求助于它们。

停止时钟

但是，研究人员究竟应该在培养皿里观察人类的发展多久呢?批评人士说，ISSCR在没有给研究人员一个新的停止点的情况下放宽14天的规定是不负责任的——它给胚胎研究开了绿灯。

傅建平是ISSCR委员会的成员，该委员会在18个月的时间里制定了新的指导方针，并参加了100多次Zoom会议。他说:“科学进步如此之快，作为一个科学界，很难再画一个停止的标志了。”相反，指导方针为进行研究敞开了大门，只要进行了适当的审查过程。

布里万卢同意这一决定。“凭我的良心，我知道在过去的14天里有很大的好处，”他说，指的是对异常染色体的研究。“它可能真的会拯救下一代人的生命。”他和Lovell-Badge认为，不允许一些14天后的研究是不道德的，因为它可以揭示器官细胞类型是如何产生的，以及流产和出生缺陷是如何发生的。

至于哪些实验和模型应该被赋予14天后胚胎研究同样的地位，也变得越来越模糊。ISSCR的指导方针划定了明确的伦理界限，只将包括支持组织的模型——理论上有完全发育的潜力——归入14天后胚胎的同一类别。(该指南还禁止将人类研究胚胎、人与动物的嵌合胚胎或人类胚胎模型移植到动物或人类的子宫中。)

一些研究人员对取消14天基准线持保守态度。例如，莫里斯认为公众没有真正的机会来衡量14天后实验的后果。

生物伦理学家约瑟芬·约翰斯顿更进一步:“我认为放弃14天规则而不提出另一个规则是错误的。”约翰斯顿是纽约加里森黑斯廷斯中心的一名生物伦理学家，他说，限制表明科学界明白社会重视人类胚胎并尊重它。取消这一限制“有可能真正动摇公众的信任”。此外，她说，研究人员需要更好地解释研究14天以上的胚胎“如何能真正帮助人类”。约翰斯顿说，他们还需要对胚胎研究的细节开诚布公。“这项研究的很多内容都让人感觉很遥远，但如果没有一些限制，就太粗心了。”