在平衡液中加入无紫外吸收的非离子形表活剂Berol 185是为了防止在凝胶过滤过程中膜碎片的聚集和杂蛋白与包涵体非特异性的结合。这样，分离和对包涵体的洗涤可以在一步凝胶过滤中实现。Fig.3是分离过程的层析谱图。表1
是凝胶过滤分离与离心分离的比较。
表1. 凝胶过滤与离心分离的比较
| |
Gel
filtration |
Differential
centrifugation |
| Initial quantity of cells (g wet weight) |
3.24 |
5.00 |
| Final quantity of scFv inclusion body |
|
|
| Mass (mg) |
168.15 |
243.75 |
| Sample volume (ml) |
29.5 |
12.5 |
| Concentration (mg/ml) |
5.7 |
19.5 |
| Protein recovery (mg/g cell wet weight) |
51.9 |
48.8 |
| Relative recovery´´ |
106.4% |
100% |
a The recovery
obtained by differential centrifugation set as 100%.
在Vo处出的峰就是包涵体蛋白质的峰，收集后加入Urea和DTE将包涵体蛋白质彻底还原溶解。溶解后的样品就可以不用离心直接应用于后继的复性过程了，但对于标准的分离的过程最后一步的离心通常是需要的。
图5.
Lanel:图3* 峰，Lane2:通过离心及洗涤得到的scFv57P，Lane3:LMW marker，Lane4:*峰后面的峰，Lane5:Ecoli的总蛋白。
不同复性方法的比较
不同复性方法的结果的比较见表2。
表2. 不同方法复性率的比较
| Refolding method |
Recovery (%) |
| Dilution (稀释复性) |
14.6 |
| Dialysis (透析) |
0.4 |
| IMAC (金属鳌合) |
14.7 |
| Gel filtration (no gradients) |
14.5 |
| (无梯度凝胶过滤) |
|
| Gel filtration (only urea gradient) |
17.3 |
| (脲梯度凝胶过滤) |
|
| Gel filtration(both pH and urea gradient) |
25 |
| (pH 与脲梯度凝胶过滤) |
|
|
稀释复性
稀释复性在蛋白质复性中很常用[6,7,8,9]。在本实验中，稀释复性用以下条件得到的复性率最高: 蛋白样品稀释200倍后至终浓度为25 mg/ml，在10℃下过夜。同时，复性缓冲液中含有0.5 M arginine，经过优化后的复性温度是10℃。
透析复性
透析复性的复性率在所有方法中最低。因为在此过程中，蛋白质的浓度变化不大，始终保持着较高的浓度，因此在复性的过程中可以很明显的观察到蛋白质的聚集，但在其它方法中，聚集并不是很明显。
用(IMAC) 进行复性
表3. 流速对IMAC复性的影响
| Flow rate (ml/min) |
Recovery (%) |
| 0.1 |
14.7 |
| 0.5 |
13.3 |
| 1.5 |
9.4 |
| 2.0 |
5.6 |
IMAC 可以用来复性有his-tag 的蛋白质[10,11]。在IMAC中，可以先将蛋白质通过histine 的作用吸附在介质上。然后，可以通过梯度的设定来逐步脱除urea 等变性剂。因此IMAC 复性可以得到比稀释复性更高的复性率。如表3 所示，低流速下可以得到较高的复性率。这也说明对于scFvfragment 逐步脱除脲比快速稀释的效果要好。
脲浓度和pH 联合梯度凝胶过滤复性
图4. 尿素与pH
联合梯度凝胶过滤复性scFv57P层析图，点线为A280nm，实线为脲梯度，点线为pH梯度。
大孔凝胶过滤介质也曾经被用于蛋白质的复性[12, 13, 14]。但象本文这样，用较小孔的凝胶过滤介质，通过逐步脱除变性剂的方法还见未报道。
我们选用预装的Susssperdex 30进行梯度凝胶过滤复性。将柱子先用脲及pH梯度预平衡后再进行复性的效果最好(Fig.4, |
