于选择合适的荧光标记物。已经有一些引物供应商获得许可,能够提供带有iso-dC碱基的引物。为方便用户,Plexor™ 引物设计软件中将包括这些供应商的信息。
定量扩增
在这种创新的定量反应中,扩增产物的积累导致荧光信号衰减,衰减程度与反应中原有的DNA模板量成反比(图3)。实时定量PCR仪是将荧光检测模块与热循环模块结合在一起的仪器,可以在每一个循环内检测信号[以相对荧光单位(RFU)表示]的变化。Plexor™反应的扩增结果表现为典型的三相曲线(图3)。在扩增过程的指数期得到的结果可以对起始起始组分给出最佳的估计。在指数期的早期设定扩增临界值。当扩增曲线穿越此临界值时的循环数被定义为样品的临界循环数(Ct)。可以使用已知量的DNA或RNA做系列稀释,把由此得到的一些列Ct值做为该样品的标准曲线。
在Plexor™反应中,dabcyl对荧光标记的淬灭是一个可逆的过程。当产物处在双链状态时,dabcyl与荧光标记物紧密相邻,荧光即被淬灭。当双链产物变性时,荧光标记物与淬灭剂分离,导致荧光信号增强。热融解曲线(Tm)可被用于确定扩增产物的融解温度(图4)。将反应体系从较低温度(约60oC)逐渐升温,达到变性水平(约95oC),可得到Tm图。产物的长度及序列可以影响Tm值,通过融解曲线能够了解扩增反应的均一程度。这一点对于评价反应的特异性非常有用,因为不同Tm值的扩增产物可以使融解曲线中出现多个峰或使峰变宽,因此可以轻易辨别非特异产物。融解曲线能够分辨特异与非特异扩增产物的特性可以确认是否仅有一种产物生成。
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