将海肾萤光素酶克隆到pF1A T7 Flexi® 载体
合成的海肾萤光素酶(hRL) 蛋白编码区已经经过优化，使其更适于在哺乳动物中表达(933bp)，使用pfu DNA聚合酶进行扩增。克隆策略显示于图4；详细的操作方法可以参考Flexi® 载体系统技术手册#TM254。简言之，958bp的海肾萤光素酶PCR 产物经纯化后，再用Flexi?酶混合物(Sgf I及Pme I)消化，产生一个941bp的片段，然后再将上述片断纯化以去除因内切酶消化而产生的小的寡聚核苷酸。
扩增后及消化后的片段纯化过程是使用Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System (Cat.# A9281)完成的。将941bp的hRL产物连接到经Flexi? 酶混合物(Sgf I and Pme I)消化的 pF1A T7 Flexi? 载体中。用连接产物转化JM109(DE3)感受态细胞，在加有氨苄西林的LB平板上进行筛选。
产生的克隆用海肾萤光素酶活性及存在的Sgf I及Pme I位点进行筛选。大多数具有氨苄西林抗性的克隆(93.7%, 267/285)含有hRL蛋白编码区，在hRL阳性克隆中，经琼脂糖电泳确定，94.5% (86/91)可以被Sgf I和Pme I消化。为了计算需要筛选的克隆数(N)，我们假定高保真扩增的准确率为99% (4)，筛选到所需克隆的可能性为99.9%。
N = ln(1–P) / ln(1–f)
在此，P是预期的概率，f是目的克隆所占的比例，它是扩增正确率、插入率及酶再切率的乘积。在这种情况下，P = 0.999, f = (0.990)(0.937)(0.945) = 0.8766 及最终的N = 3.3。
因此，筛选3或4个克隆便能找到所需要的克隆。对3个 pF1A-hRL 克隆测序确认其插入片段，全部正确。挑选其中一个克隆作进一步的研究。
图3. 通过扩增添加Sgf I及Pme I位点。Sgf I位点位于起始密码子上游。依据载体骨架的不同，或者在起始位点从头启动，或者通读，在氨基末端添加短肽。根据载体的骨架,增加的Pme I位点在蛋白编码区的3’末端添加一个的缬氨酸密码子，可以用于终止或通读添加在羧基末端肽。扩增海肾萤光素酶时，氨基 (5′)引物序列为GTCAGCGATCGCCATGGCTTCCAAGGTGTACGAC, 羧基 (3′)引物序列为CTTCGTTTAAACCTGCTCGTTCTTCAGCACGC。