应用报告
 

0.1 M的NaOH虽然能有效地进行在位清洗,但却会损伤蛋白A。当在室温时蛋白A与0.1 M 的NaOH接触达到41 小时时,蛋白A 的载量会下降54%。在0.1 M 的NaOH 清洗液中添加乙醇能有效地保护蛋白A。在位消毒剂需要能有效地使细菌和病毒失活而又能保护蛋白A的活性。新的消毒剂应该能在与凝胶接触41小时后蛋白A的活性任然大于90%,而且能在30 分钟内使细菌和病毒减少大于5 logs。

保存缓冲液没有更换,因为在临床生产中没有发现有革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、霉菌或酵母的生长。

最后,PDL发现通过ProteinA 循环生产证实,Mabselect 能经济有效地每批生产20 kg 人源化抗体。

四、成功案例[4]
位于德国匹兹堡的罗氏公司将一种用于肿瘤治疗的单克隆抗体用于临床。他们已经明确知道现有的高容量的蛋

 

白A介质可以用来纯化这种单克隆抗体,在将目前商用的几种蛋白A介质进行充分的比较之后, 由于MabSelect的高容量、高稳定性,以及易于被填充和清洗等特性而最终被罗氏公司选择应用。目的蛋白是通过无血清培养的转染的杂交B淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到一根MabSelect 填充的FineLINE 柱子,柱床的高度为20 厘米,上样的浓度是30 mg/ml,流速大约是100 cm/h (流速只受所用系统的制约)。经过清洗和洗脱后,洗脱液立即用磷酸钾中和,将pH值调节到6.8到7.0。再用凝胶过滤检测,结果表明比活超过90%,纯度在95% 以上。

参考文献
1. Amersham Biosciences, Affinity Chromatography
 Datafile of Mabselect.
2. Amersham Biosciences, Downstream 36, p12-14.
3. Amersham Biosciences, Gab2002.
4. Amersham Biosciences, Downstream 33, p6-8.

 
新高产率离子交换介质Capto Q
一天内纯化超过100 公斤级绿色萤光蛋白
 

摘要
本应用用新的强阴离子交换剂Capto™ Q的层析介质,从匀浆过,澄清的Escherichia.Coli 中捕获绿色萤光蛋白(GFP)。这种新介质大大提高了生产率及减少工艺循环时间。

本文介绍了筛选、工艺过程优化以及按比例放大的结果。用内径为0.8 m,床高为20 cm 的Capto Q 柱,每24 小时能捕获和回收超过100 kg的GFP。而在相同的工艺过程循环条件下,相应量的Q Sepharose™ Fast Flow 则得到30 kg。这个结果表明Capto Q 非常适用于高生产率的捕获纯化。

材料与方法

● 样品及目标蛋白的性质
 目标蛋白的PI = 6.2→ 阴离子交换剂纯化起始于pI+2 =pH 8.2
 目标蛋白在起始物料中的表达水平:~ 2.5 mg GFP/ml
 目标蛋白的稳定性→ 高pH可能危及蛋白活性(如脱氨反应)
● 最终规模
 24小时纯化100 kg靶蛋白→ 需要大体积上样量
 缓冲液和清洗液必须适用于大规模工艺过程,即符合常
 规的经济、易 保存等条件

介质筛选、工艺过程优化:
● 用预装HiTrap柱,进行不同阴离子交换剂的选择性筛选
● 筛选工作pH
● 测定动态结合容量
● 将线性盐洗脱转换成阶段洗脱
● 进行平衡/再平衡/冲洗液体积的优化
 
按比例放大:
● 将保留时间保持恒定,增加床高和流速。通过洗脱
 图形的比较,确定按比例放大纯化工艺过程,以及测
  出 纯化因子,洗脱体积,和在这些不同规模之间的产
  量。
● 生产率计算结果表明24小时能回收24 kg靶蛋白

图1. 试验概况

将在E.coli 中表达的重组绿色萤光蛋白(GFP)用作模型蛋白。在对几个阴离子交换剂进行初步的选择性筛选后,将方法放大、优化并在FineLINE™ 70 柱上进行中试,然后再进行按比例放大,结果表明可在24 小时内至少生产100 kg 靶蛋白。这是大规模的蛋白纯化的标准。

结果和讨论
筛选介质
用HiTrap进行筛选以确定五个阴离子交换介质的选择性。对280 和490 nm 的洗脱图形及吸收曲线(图2),显示出介质之间选择性的差别。在Q Sepharose Fast Flow,Q Sepharose XL和ANX Sepharose 4 Fast Flow (high sub),GFP 的洗脱峰含有几个其他蛋白,而Capto Q 和DEAE Sepharose Fast Flow 的GFP的洗脱峰与杂质分的更开。此外,使用Capto Q,杂质在靶蛋白之前被洗脱,更能有助于GFP 的纯化。因此,在筛选的五个介质中,Capto Q 的洗脱图形最好。

 
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