摘 要
　　 Flexi®载体系统可以使蛋白编码区在不同的表达载体或带有不同短肽标签的载体之间转换，这一系统快速、高效且保真度高。酶切后的插入片段可以高效地在Flexi® 载体间转移而保持原来的插入方向及读码框。在克隆的最初阶段，Flexi® 载体克隆区域的自杀基因可以用于阳性克隆的筛选。抗生素抗性基因则简化了所需克隆转入其它Flexi® 载体时的筛选。

介 绍
　　Flexi® 载体系统使用两种稀有内切酶，Sgf I及Pme I，来完成蛋白编码序列的定向克隆。这种方法简便而有效。经过Sgf I及Pme I的消化后，插入片段可以高效地转移到其它Flexi® 载体，保持插入片段的原有方向及读码框，而不需要在每一次转移后重新测定插入片段的序列(图1) 。这种方法可以容易地适用于高通量方式。

　　与位点特异的重组载体不同， Flexi?载体系统不需将多种氨基酸加到感兴趣的蛋白上。。本系统不需要入门载体，对于大多数实验，可以直接连入最符合实验设计的载体（例如：哺乳动物表达或N-末端带有GST-融合蛋白的载体）。

图1. 蛋白编码区在Flexi® 载体系统中的转移。Flexi® 载体使用灵活的定向克隆方法，用于表达带有或不带有融合标签的蛋白。载体骨架上带有表达所需的元件及融合标签，使用两个稀有内切酶SgfI及PmeI可以将蛋白编码区在载体之间转移。Flexi® 载体含有自杀基因，用于蛋白编码区的阳性筛选。含有的抗生素抗性标记用于筛选含有Flexi® 载体的克隆。

图2. Flexi® 载体。

　　Flexi® 载体系列有不同的表达载体或带有短肽标签的载体可供选择，用于表达天然的或融合的蛋白，从而研究蛋白结构及功能，或蛋白-蛋白的相互作用(图2)。

 通过PCR，利用Flexi®载体捕获ORF
　　 Flexi® 载体使用两种稀有的限制性内切酶: Sgf I及Pme I。在人的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）序列中，Sgf I的限制性酶切位点最少，而Pme I其次。这些酶在其它许多生物的开放阅读框中的使用频率也很低。在定向克隆时，现有大多数人(99%)的开放阅读框不受这些酶的影响。但是我们建议检查你的蛋白编码区有无Sgf I及Pme I位点。如果你的蛋白编码区含有这些位点，可以考虑克隆蛋白编码区的一部分或使用RecA蛋白保护蛋白编码区的Sgf I 或Pme I位点不被消化(1)。或者，基于PCR的定点突变方法(2,3)也可以在不改变氨基酸序列的前提下突变内切酶位点。

　　Sgf I及Pme I位点是采用PCR方法加在蛋白编码区上的。为了方便克隆，在扩增蛋白编码区的5′PCR引物(正向引物)加上一个Sgf I位点, 而3′引物(反向引物)加上一个Pme I位点(图3)。Sgf I位点被置于起始密码子上游一个碱基处。这样可以在Flexi®载体上的原始翻译启动位点从头启动而不会产生融合蛋白，并且可以通读Flexi?载体上的Sgf I位点，产生N-末端融合蛋白。Pme I位点被安排在C－末端，在蛋白编码区最后一个氨基酸处加一个缬氨酸残基。紧跟缬氨酸密码子GTT的是一个终止密码子，TAA。一旦将Sgf I 及Pme I酶切的蛋白编码区克隆进同样酶切的载体，即创建了翻译终止密码。你可以通过引物设计将Pme I位点置于原始终止密码子的下游，这样，翻译在原始终止密码子处终止，而不会在蛋白上加上缬氨酸残基。但是，如果这样做，你将来的表达蛋白将不能带有C-末端融合。通过将蛋白编码区的Pme I 平头末端与由另一内切酶(如EcoICR I)产生的平头末端融合可以得到C-末端的融合蛋白。以下站点提供引物设计软件：www.promega.com/techserv/tools/flexivector/