qPCR技术介绍（五）——绝对定量与相对定量

qPCR技术介绍（五）——绝对定量与相对定量

Real Time PCR，即实时荧光定量PCR，也被称为定量PCR或qPCR，是实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法。 Takara以专业的精神，结合定量PCR实验的国际标准MIQE原则，综合Takara先进的研发技术、标准严谨的实验操作和丰富的技术支持经验，为您带来【定量PCR课堂】，内容包括定量PCR的原理、实验设计、实验操作、数据分析和疑难解答等相关知识。

Takara定量PCR课堂第一讲——基础概念篇
Takara定量PCR课堂第二讲——RNA提取 & 反转录
Takara定量PCR课堂第三讲——PCR反应
Takara定量PCR课堂第四讲——数据解析篇

一、绝对定量 vs 相对定量

定量方法可以区分为绝对定量和相对定量两大种类。
绝对定量是对未知样品的绝对量（拷贝数）进行测定的方法。
而相对定量，并不是测定基因的绝对量，而是分别测定目的基因和参比基因的量，再求出对于参比基因的目的基因的相对量，最后再进行样品间相对量的比较。
我们不能简单地说绝对定量准确还是相对定量准确，而只能说它们的应用领域不同。绝对定量应用于病毒病原菌定量检测、转基因拷贝数分析、GMO定量分析等领域；相对定量主要应用于mRNA表达量解析，如果此时采用绝对定量的方法，就不能得到准确的解析结果。

二、绝对定量

【绝对定量解析方法】
构建已知浓度的标准品
（标准品制备相关介绍，请参考上一篇推送qPCR技术介绍（四）

对标准品进行5～6个梯度稀释

标准品和待测样品同时进行RT-qPCR或qPCR反应，得到Ct值

仪器软件根据输入的标准品浓度和测得的Ct值，绘制标准曲线

仪器根据待测样品的Ct值在标准曲线上的位置，获得待测样品的浓度（或拷贝数）

二、相对定量

相对定量，一般是为了比较感兴趣的目的基因，在不同的样本中表达量的差异。
那么如果通过前面介绍的绝对定量的方法，制作目的基因的标准曲线，再把几个待测样本中目的基因的Ct值带入曲线，获得目的基因的绝对量，再进行倍数关系比较，是否可以呢？

【引入参比基因的必要性】

不同的样品，即使反应时使用相同量的Total RNA，但因细胞来源不同，RNA的总表达量并非一致。因此仅仅将反应时RNA量统一，起始的细胞数也不一定相同。而进行表达量比较时，不是RNA量相同，而是相同细胞数的RNA才是最重要的。

实际上要将样品材料（组织、细胞、菌体等）统一到相同细胞数提取，是非常困难的。同时还不能保证RNA提取效率完全相同、PCR扩增效率完全相同等。

基于以上原因，利用Real Time RT-PCR方法进行基因表达解析，有必要选择House Keeping Gene（管家基因）作为参比基因来对所有样品进行归一化处理（RNA量校正），然后再对不同样品之间的目的基因表达量进行比较。

分别测定不同样本中目的基因和参比基因的量，再求出对于参比基因的目的基因的校正值，最后再进行样品间校正值的比较。

校正值=

目的基因定量结果

参比基因定量结果

表达量比值=

样品A的校正值

样品B的校正值

【管家基因的选择】

管家基因，是指所有细胞中稳定表达的一类基因，在qPCR中这类基因经常被选为参比基因，用来对所有样品进行归一化处理。
以前，GAPDH、β-actin基因常被作为管家基因使用，但近几年也常有这些基因因样品经药物等处理后表达量发生变化的报道。
目前，很多研究者认为一种管家基因有可能校正不充分，同时使用两个或两个以上的复数管家基因进行校正更值得信赖。
当然这种校正方法也是非常耗费精力的，通常要选择若干个管家基因同时进行表达量分析，从中选择表达量变化幅度小的管家基因来使用。
选择最适校正基因的软件有很多，请下载利用（geNorm、BestKeeper等）。

【△△Ct法与双标准曲线法】

相对定量解析大多采用标准曲线的定量方法，但也有不采取制作标准曲线的定量方法，如△△Ct方法等。

1、标准曲线法

需要分别制作管家基因和目的基因的标准曲线，仪器计算得到样本的Ct值对应的定量值、校正值，进而得到校正值的比值，即样本间表达量的差异。这种方法得到的相对表达量结果更接近实际情况。