| “酶”那么那么重要，NGS的PCR扩增酶该如何选择？ |
| |
NGS技术横空出世以来，更高的通量，越来越低的成本，使其在生物医学等领域应用越来越广泛。
NGS测序流程主要分为样本制备、文库构建、上机测序和数据分析四个流程。其中，构建测序文库，是NGS实验流程非常关键的步骤，直接影响测序质量。适合NGS文库构建的PCR酶，需要具有高保真、低扩增偏差、以及能够无偏倚地扩增不同大小和GC含量的靶标等优势，因此需要谨慎选择。
Takara作为PCR酶领域的翘楚，有非常多品质高的高保真酶。今年推出的高保真DNA聚合酶PrimeSTAR® Max DNA Polymerase Ver.2，具有高效、高保真和低偏好等特点，能够应对NGS文库扩增的挑战。
|
| |
|
构建文库过程中的突变会给后续序列拼接造成困难，甚至可能会干扰某些需要低频检测的分析结果，因此高保真性的扩增是非常重要的。
Takara PrimeSTAR系列高保真酶凭借其错配率低、保真性高、性能卓越等优势而畅销，赢得了众多科研人员的倾心与认可。PrimeSTAR® Max DNA Polymerase（Ver.2）更是该系列中保真性最高、反应（延伸）速度最快的高保真酶。
Takara Bio研究团队以λ DNA（10 kb）为模板进行PCR反应，通过分析PCR产物的碱基序列，评估各个PCR酶的保真性。PrimeSTAR® Max DNA Polymerase Ver.2显示出与同类型产品相比最高的保真性，大约是TaKaRa Taq™ 的420倍。
|
 |
| |
|
Takara Bio研究团队比较了PrimeSTAR® Max DNA Polymerase（Ver.2）与A公司和B公司的高保真PCR酶/PCR扩增混合物用于NGS的文库扩增。分别以100 ng的200 bp和300 bp HL60 DNA fragments为模板，构建测序文库，其中分别使用上述三种不同的高保真PCR酶/PCR扩增混合物进行扩增步骤（均使用酶试剂制造商推荐的体系和程序进行PCR扩增）。之后使用Illumina NovaSeq X （PE150）测序，Downsampling 至60M reads进行数据分析。
|
| |
·文库产量评价
保证文库产量，有利于足够用于质检和后续上机测序。从以下结果可以看出，PrimeSTAR Max DNA（Ver.2）相较于其他两种同类产品，有更高的文库产量。
|
| |
★ 200 bp Fragments
|
 |
| |
★ 300 bp Fragments
|
 |
| |
·文库片段长度评价
上机文库的质量评价指标之一是文库片段长度。过低的片段长度可能是引物二聚体，过高的片段长度(远高于DNA片段加接头的长度)则为大片段，大小片段的存在都会影响测序数据量的产出。从以下Agilgent 2100结果可以看出，不同酶扩增的文库片段长度无明显差异。
|
| |
★ 200 bp Fragments
|
 |
| |
★ 300 bp Fragments
|
 |
| |
·GC覆盖度评价
实现一致、均一的GC覆盖度并不容易，要求文库构建系统对不同GC含量的基因组都能提供正确、均一的覆盖。以下结果表明，PrimeSTAR Max DNA（Ver.2）表现了高覆盖率和良好的覆盖率均匀度。
|
| |
★ 200 bp Fragments
|
 |
| |
★ 300 bp Fragments
|
 |
| |
·测序分析结果
下表数据显示，三者构建的文库的reads数据量、重复率均一性基本相当！
|
| |
 |
以上数据来源于Takara Bio USA, Inc.
以上实验结果说明，PrimeSTAR® Max DNA Polymerase（Ver.2）（Code No.R047A/S）是NGS文库扩增的优选酶。
|
| |
|
我们准备了免费试用样品【Code No. R047S（50 μl反应体系 × 25次）】。
审核成功可以获得1 PC R047S。
|
| |
|
|
