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| 做二百重的PCR，酶您选好了吗？ | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| 多重PCR也称复合PCR，它是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术。它的基本原理与常规PCR相同，区别在于多重PCR是在反应体系中加入了两对以上引物，各对引物分别结合在模板相对应部位，最终扩增出两条以上目的DNA片段。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 多重PCR可以在同一反应管内同时检测、鉴别出多种病原体或者基因型，具有系统化、高效、简便、经济、节省试剂和珍贵样本的特点，能够提高样本的利用率，因此也被广泛应用于多种基因检测领域，例如： | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ● 临床病原微生物检测 ● 病毒检测 ● 食品安全检测 ● 植物分子育种与病虫害检测 ● 产前诊断 ● 肿瘤用药指导等研究 |
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| 特别是随着NGS技术的发展，使得对PCR产物进行高灵敏度、高分辨率的检测成为了可能，例如病原靶向测序（tNGS）方法，就是将多重PCR与NGS技术相结合，可以对待测样本中几十种甚至成百上千种已知病原微生物或耐药基因进行检测，在临床检验领域受到了广泛的关注。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| 多重PCR需要在同一反应体系内对多个位点进行特异性扩增，但并不是引物和模板简单的混合及叠加，其难点在于如何兼容多个靶标之间的扩增条件，以及考虑多组引物对之间的结合与竞争性扩增，最终实现多个靶标的均衡、特异性扩增。所以在进行多重PCR实验时，要根据实际情况对实验条件不断优化，通常我们会从反应体系和反应条件两个方面进行优化，反应体系包括引物的设计及反应浓度 、反应缓冲液的体积及其盐离子浓度、模板质量及浓度、PCR酶及浓度、dNTP及Mg2+浓度等；反应条件包括退火时间及温度、延伸时间及温度、反应循环数。 在这些影响因素中，PCR酶及buffer的影响更多的依赖于商品化产品的性能以及实验者的选择，鉴于多重PCR的反应原理和特点，PCR酶需要具备扩增能力强、高收量、高灵敏度等特点，因此，选择对了PCR酶，就会让多重PCR实验达到事半功倍的效果！ Takara公司在多重PCR应用方面拥有多款产品，可助力您突破重重难关！ |
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| Titanium Taq DNA聚合酶是一种通过基因工程手段特殊改造的Taq酶，缺失了野生型Taq酶的5'-3'外切酶活性，使其具备更强大的扩增性能，可用于扩增高度复杂的DNA混合物。同时还精心设计了氨基酸替代物，以增加其溶解度，进而增加其灵敏度。Titanium Taq添加了Hot Start PCR抗体，可防止非特异性扩增和引物二聚体的形成，适合各种样品，包括细菌和质粒DNA、cDNA和复杂基因组DNA等。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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| Titanium Taq还有个优势就是在较宽的Mg2+浓度范围内具有良好的扩增性能，可缩短优化实验所花费的时间，尤其在进行多重PCR时，不同的靶序列对Mg2+的浓度需求可能会有所不同，使用Titanium Taq会使优化过程更加简单。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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| Titanium Taq DNA聚合酶已经过验证适用于多重PCR反应，已在Affymetrix microarray以及Mass ARRAY系统中(Jurinke et al. 2012)实现了应用。使用Titanium Taq DNA聚合酶进行多重PCR的实验例如下图所示： | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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| SuperPlex Premix是一款包含Takara Bio高收量PCR酶Titanium Taq的hot-start型2倍浓度的预混液，仅需较少的PCR循环就能够得到低背景的检测结果，是多重PCR和高产量单重PCR的理想选择，可更大限度地减少优化多重反应所需的时间。本产品包含了多重PCR所需的全部试剂，只需添加引物、模板和水即可进行PCR反应，减少由繁琐操作带来的实验误差。 实验例：使用SuperPlex Premix进行多重PCR，体验扩增均一性与速度并存！ 在对人CFTR基因进行20重PCR的研究中，为了进一步减少测定时间，使用SuperPlex Premix推荐的较少的PCR循环数，对不同品牌多重PCR试剂的性能进行了测定，结果显示，仅SuperPlex Premix能够获得良好的实验结果，其他产品均出现了不同程度的smear甚至没有扩增结果的情况，这说明使用Superplex Premix不仅可以获得均一的扩增结果，并且可以帮助我们节省更多的时间！ |
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| 上表为对人CFTR基因进行20重PCR的研究中，各公司推荐的PCR循环时间。使用SuperPlex™ Premix做多重PCR的循环时间最短。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Multiplex PCR Assay Kit Ver.2可在短时间内特异性地进行无偏差的PCR扩增，非常适合多重PCR反应，通过调整酶量和反应条件，可进行约200对引物的多重PCR。此外也可以用于普通的单重PCR反应，尤其是在目的片段难扩增、非特异性条带及Smear大量出现时使用，可在短时间内特异性扩增目的片段。 Multiplex PCR Assay Kit Ver.2是一款诞生于2015年的产品，上市初衷是面向从事基因分型、表达等基础研究以及NGS研究的客户，一直不温不火，近年来，随着遗传病检测、传染病防控力度的加大，以及肿瘤患者数量的不断增长，市场对多重PCR的检测需求持续提升，使得Multiplex PCR Assay Kit Ver.2这款产品也越来越受到相关研究人员和机构的关注，好评如潮。作为一款险些湮没在时光洪流中的经典产品，Multiplex PCR Assay Kit Ver.2用实力完美的诠释了是金子总会发光的深刻哲理。 |
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| 普通单重PCR反应实验例 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 10重PCR反应实验例 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 反应时间对比 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 207重PCR用于NGS分析的应用例 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| 使用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2（Life Technologies）和本产品、以人基因组DNA为模板对207个目的基因进行Multiplex PCR，制备文库后进行NGS测序。 此外，从中任意选取16个目的基因使用qPCR对Multiplex PCR扩增产物进行定量，通过与扩增前人基因组DNA的定量值（PC）和C公司产品扩增产物的定量值进行比较，确认PCR扩增产生的偏好性程度。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 确认多重PCR扩增的基因 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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以上介绍的三个系列产品可谓各有特点和侧重，Titanium Taq作为一款高性能PCR酶推出较早（1998年），随着科研领域的不断进步和发展，研究人员的反复尝试和验证，渐渐在多重PCR应用方面崭露头角，属于“兼职”，相对而言，实验时需要更多的摸索和优化；而另两个系列可以说是为了多重PCR而生，属于“全职”，SuperPlex Premix作为新生力量主打性能和速度并存，预混型更方便操作，Multiplex PCR Assay Kit Ver.2虽然是非预混型的“老将”，但贵在有200重PCR的“工作经验”傍身，对于从事数十重、数百重PCR研究的人员来说，更容易取得成功。 |
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| 产品列表： | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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| *1：产品更多规格，请登录官网www.takarabiomed.com.cn查看。 *2：Titanium® Taq SP系列中包含的Titanium Taq DNA Polymerase 和TaqStart Antibody与常规Titanium Taq产品相同，不同点在于SP系列含有改良的、免授权的缓冲液配方，适合商业和OEM用途，包括用于分子诊断服务和试剂盒。上表也列出了SP系列预混型冻干版本、无甘油版本的产品信息。 |
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