防止PCR产物污染造成的假阳性

PCR是一种常用的DNA扩增技术，但因其高灵敏度的特性，极易受污染影响，而扩增产物的污染会导致假阳性结果产生，特别是采用End-point PCR方法，在食品、环境检测等方面应用时，由于相同的PCR反应的重复操作而带来的危险性更高，给结果判定造成很大影响，令人头疼。

针对PCR产物污染，可以提升防污染操作技巧或针对性的选用UNG酶试剂盒，从而最大限度的避免假阳性的产生。

防污染技巧

从反应液的配制到PCR产物的检出应分别在4个相对独立的操作区操作，操作区推荐进行物理性隔离。

      操作区1：反应液的配制及分装。
      操作区2：样品的制备。
      操作区3：将样品添加到反应液中。
      操作区4：PCR反应及凝胶电泳对PCR产物进行检出。

为防止污染，除在操作区4外，请避免对装有PCR扩增产物的tube进行开闭。

UNG的作用原理：

在PCR反应前25℃、10 分钟反应中，UNG 酶可水解PCR反应液中含有尿嘧啶的PCR产物的尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架的N-糖苷键，产生脱嘧啶位点。随后进行95℃、2分钟热处理，在UNG酶失活的同时进一步对磷酸骨架水解，从而消除含有尿嘧啶的PCR产物的污染。

使用含有dUTP代替 dTTP的基质进行PCR扩增，其扩增产物嵌入了尿嘧啶碱基，针对这种扩增产物的污染，用UNG 酶 (Uracil-N-glycosylase) 处理，再进行PCR反应，含有尿嘧啶的污染的扩增产物被降解，而只有不含尿嘧啶的检测样品来源的DNA才能够作为模板被扩增，从而防止假阳性的产生。

目前，UNG+dUTP防污染体系的热启动PCR反应技术被广泛应用在各种防污染研究中，包括甲基化基因检测、全血检测和甲、乙型流感病毒及新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测等实验体系中。

扩增产物污染的消除效果确认：

【方法】以10 ng人基因组DNA为模板，扩增500 bp的DNA片段(1st PCR)。再以2 μl 1st PCR产物为模板进行UNG酶(+)及UNG酶(-)处理，使用1st PCR的反应条件进行PCR扩增(2nd PCR)，确认扩增产物污染的消除效果。

【结果】进行UNG酶(+)及UNG酶(-)处理PCR反应均以2 μl的10 ng人基因组DNA 扩增的500 bp DNA片段为模板，2个反应的结果差异证实了扩增产物污染的消除效果，有UNG处理时，1st PCR产物经UNG处理而降解，因此2nd PCR无PCR扩增产物检出。

验证扩增产物的稳定性

【方法】使用Uracil-N-glycosylase(UNG)进行防止扩增产物残留污染的PCR反应体系，如果UNG酶失活不完全，扩增产物被分解，会导致错误的PCR检测结果。微量的目的基因扩增，扩增产物少时要特别注意。

【结果】添加Uracil DNA Glycosylase(UNG), heat–labile进行了PCR反应后，在室温下放置96小时后也没有观察到扩增产物的降解。

数据来源于Takara Bio Inc.

制品应用

一、工业客户的理想选择UNG酶：

Code No.：2820/Uracil DNA Glycosylase (UNG),heat-labile

二、可防止PCR假阳性反应的试剂盒

热敏感UNG、含有dUTP的基质溶液，TaKaRa Taq HS组合成使用方便的Kit：
Code No.：R013/TaKaRa Taq™ HS PCR Kit, UNG plus

可将您平常使用的Taq 酶直接替换成本产品试用：

本制品是一种可防止假阳性产生的试剂盒。使用本制品是在PCR反应时以dUTP取代dTTP，并同时使用Hot Start型DNA聚合酶TaKaRa Taq HS进行PCR扩增反应。反应液配制后，对含有dU的DNA具有降解作用的UNG酶（Uracil-N-glycosylase）可选择性水解含有尿嘧啶的PCR产物，而对不含尿嘧啶的模板无任何影响。

如不想替换目前使用的PCR酶，推荐使用：
Code No.：6088/TaKaRa PCR Carryover Prevention Kit

本试剂盒除含有UNG酶外，还附带含有dUTP的dNTP Mixture以及MgCl₂溶液。使用本试剂盒时请与TaKaRa Taq Hot Start Version (Code No.: R007A/B) 等Pol I 型PCR酶组合使用。

三、快速反应的探针法检出qPCR试剂(UNG版)

Code No.：RR392/Probe qPCR Mix, with UNG

四、病毒、细菌快速检出的探针法1 Step RT-qPCR专用premix试剂(UNG版本)

Code No.：RR601/One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix, with UNG

五、无需核酸提取的直接qPCR技术（UNG版本）

Code No.：RR651/PrimeDirect ^® Probe RT-qPCR Mix, with UNG

六、UNG体系下专用dNTP试剂：

Code No.：4035/dU plus dNTP Mixture (12.5 × )

UNG产品一览表：

持续使用Takara UNG plus系列，能够防止PCR产物污染造成的假阳性，提升基因检测的可信度。

Takara Bio中国官网