简单快捷的mRNA加帽帮手

1. 背景介绍

随着IVT（体外转录，In Vitro Transcription）技术在疫苗、药物研发等多个领域愈发火热，mRNA的加帽技术也逐渐受到大家关注。5‘鸟嘌呤-N7-甲基帽子结构是真核生物mRNA非常明显的特征，在mRNA剪接、mRNA出核、翻译起始等方面起到关键作用。mRNA帽子结构还可以保护其免遭5’-3‘外切核酸酶降解，从而稳定mRNA结构。如果没有帽子结构将导致mRNA不可逆降解。因此，如何在体外合成的mRNA上添加帽子结构，在IVT技术中是非常重要的一个部分。

mRNA的帽子结构分以下几种：

注：目前用于疫苗接种的人工mRNA结构是Cap 1 RNA

目前已知的加帽方法有两种，一种是共转录加帽法，另一种就是今天介绍的酶促修饰法。酶促修饰法是使用Vaccinia Capping Enzyme（牛痘加帽酶）和mRNA Cap 2ʹ-O-Methyltransferase（甲基转移酶）共同作用，将未修饰的mRNA转化为Cap 1结构的mRNA。

2. 酶促加帽法基本原理

mRNA Cap 0的形成，需要使用Vaccinia Capping Enzyme（牛痘加帽酶），牛痘加帽酶作为一种酶复合物，具有3种酶活性，分别为RNA三磷酸酯酶（triphosphatase），鸟苷酸转移酶(guanyly tranferase)，甲基转移酶(guanine-N7-methyltransferase )。

第一步：RNA三磷酸酯酶负责去除mRNA原始转录本5’端的磷酸盐，产生5’末端只含有2个磷酸基团的mRNA结构。
第二步：GTP作为供体提供GMP，鸟苷酸转移酶将GMP添加到mRNA 5’末端，形成5’-5’三磷酸连接的未甲基化的帽子结构。
第三步：甲基转移酶利用SAM作为甲基供体将mRNA5’末端未甲基化的鸟嘌呤碱基N7位置甲基化。

2′-O-methyltransferase（2’-O-甲基转移酶）利用S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)为甲基供体，在RNA 5’端紧邻帽结构(Cap 0)的第一个核苷酸的2’-O位点添加甲基，形成带有Cap 1结构的mRNA。

3.新产品介绍

Takara推出了新产品Vaccinia Capping Enzyme（Code No. 2460A/B）及mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase（Code No. 2470A/B），在使用酶促修饰法添加帽子结构方面给您提供了更高效、更稳定、更经济的理想选择。

>>产品列表

>>应用

1. Cap 0 mRNA的制备
2. 标记5’末端mRNA
3. Cap 1 mRNA的制备

>>产品特点

最快可通过一步法，将未加帽的mRNA加上适合mRNA疫苗生产使用的Cap 1结构
与传统共转录法相比，加帽效率更高
灵活的适应性以及广泛的底物接受度
适用于特定 5’-cap 改造所需的不同应用

可与一步法或两步法两种方法配套使用，添加Cap 1结构：

>>实验例

与其他公司同类型产品5’端加帽效率的比较：根据各公司产品操作说明使用

Takara Bio Inc.比较结果

使用荧光素酶活性测定的方法，通过测量HEK293T中Fluc荧光表达水平（作为蛋白表达水平）来评估FLuc mRNA的5’加帽效率，对酶加帽后的RLU（相对发光单位）水平进行测定。结果显示，使用CleanCap试剂共转录加帽法的RLU水平最高，无论一步法还是两步法，在表达水平上，Takara试剂都稍稍优于A公司同类型产品。

Takara Bio中国官网