奥地利OROBOROS细胞能量代谢分析仪

奥地利OROBOROS细胞能量代谢分析仪

德国INCYTON实时全息多参数细胞能量代谢分析平台

生物体能量代谢在脑科学研究中具有引导性定位，在分子、细胞水平的神经科学中，包括阿兹海默症的病理学和认知、线粒体自噬与神经毒性、树突状细胞与脂肪酸合成、线粒体氧化磷酸化与脑损伤恢复等等多个方面，可以多角度/多方向研究脑科学、神经科学的病理与治疗，为脑科学研究者提供更专业的研究平台。

探索生命的力量

各复合物在氧化磷酸化过程中的功能角色1

复合物I( complex I)

复合物I( complex I)：即NADH-CoQ还原酶，又称NADH脱氢酶。哺乳动物的复合物I作为电子进入呼吸链的起始点，在整个氧化磷酸化反应过程中发挥着至关重要的作用，其功能障碍会引起细胞呼吸作用至少百分之40的衰减，进而导致多种疾病，诸如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、嗜酸细胞型腺瘤、遗传性视神经病变、婴儿致死性线粒体病、Leigh综合征、糖尿病以及肥厚型心肌病等。

复合物II( complex II)

复合物II( complex II)：琥珀酸脱氢酶是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。琥珀酸脱氢酶的突变和异常往往与多种疾病有关，常见包括：副神经节瘤（PGL）和嗜铬细胞瘤（PHEO）、胃肠道间质瘤（GIST）、肾细胞癌、 Leigh综合征等。

复合物III( complex III)

复合物III( complex III)：复合物Ⅲ又称CoQH2-细胞色素c 还原酶复合物, 总相对分子质量为250kDa。通过将细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）和复合物分析技术相结合获得的信息表明，CIII在SC形成中作为整个呼吸链生物发生的结构和功能平台具有新的主要作用。CIII的功能缺陷将引起肺动脉高压、人类CIII缺陷症、 GRACILE综合征、脑病、Leber 遗传性视神经病变、心肌病和肌病等。

复合物IV( complex IV)

复合物IV( complex IV)：复合物Ⅳ又称细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)。复合物IV代表线粒体呼吸链的限速酶，其活性是细胞氧化能力的指标。因此，它注定是调节氧化磷酸化，质子泵送效率，ATP和活性氧产生的主要位点，这反过来又影响细胞信号传导和存活，复合物IV的缺陷已被证明会导致许多疾病，包括Leber遗传性视神经病变，Leigh综合征，复发性肌红蛋白尿线粒体疾病，耳聋感音神经性线粒体疾病和结直肠癌、年龄依赖性肥胖、新生儿呼吸窘迫综合征、亨廷顿舞蹈症等。

线粒体是如何产生能量的

各复合物在氧化磷酸化过程中的功能角色2

线粒体复合物V或ATP合酶

线粒体复合物V或ATP合酶是一种酶复合物，作为分子机器在线粒体呼吸过程的下一步在细胞中产生和水解ATP。因此，ATP合酶不仅在维持细胞能量状态方面起着关键作用，而且在决定线粒体呼吸功能方面也起着关键作用。 ATP合酶活性失调应对线粒体呼吸产生重大影响，从而影响心脏、神经系统的表现。例如：靶向 ATP 合酶调控作为心脏疾病的治疗靶点、线粒体ATP合酶的失调和功能障碍已成为阿兹海默症的细胞标志之一， ATP合酶能够调节能量代谢并调节导致ROS形成，细胞死亡和存活的途径、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、帕金森病等.

NADH

NADH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(+))是真核细胞中的一种代谢辅因子，在调节细胞代谢和能量平衡方面起着重要作用。NAD(+)以其还原形式(即NADH)作为线粒体呼吸链的主要电子供体，参与氧化磷酸化产生三磷酸腺苷。

辅酶Q(CoQ)

辅酶Q(CoQ)是一种重要的辅因子，主要存在于线粒体内膜上，在呼吸链中起电子载体的作用，也是一种亲脂性抗氧化剂。辅酶Q(10)缺乏症在临床和遗传上是异质性的。该综合征与五种主要临床表型有关：(1)脑肌病，(2)严重婴儿多系统疾病，(3)小脑性共济失调，(4)孤立性肌病，(5)肾病综合征。呼吸链缺陷、活性氧的产生和细胞凋亡在原发性辅酶Q(10)缺陷的发病机制中起着不同的作用。

能量代谢的检测往往与多方向的科研领域相关，传统的测量方法往往集中在细胞整体层面上能量表达的改变，而忽略了其能量代谢本质上是线粒体功能的缺失、数量的增减；Oroboros O2k高精度能量代谢分析系统针对细胞、组织内的线粒体功能，尤其是氧化磷酸化过程中的复合功能蛋白进行针对性检测，确定病变部位能量改变的真实作用靶点，纵向挖掘线粒体的本质变化。能量代谢研究常应用于肿瘤、肥胖、糖尿病、衰老、药理、毒理、运动、营养、遗传等多种研究领域。

线粒体(mitochondria)是一种具有半自主性的细胞器(semiautonomous organ-els),它有自身独特的遗传系统。进行有氧呼吸的酵母、原生动物和高等动植物细胞都有线粒体，但很多哺乳动物的成熟红细胞却例外，它们的线粒体在红细胞发育成熟的过程中逐步退化消失。生物体内的生物合成、呼吸、分泌及机械运动等全部细胞活动所需要的化学能都是由线粒体提供的。通过十分复杂而又相互关联的一系列综合反应和电子传递，线粒体利用糖和脂肪酸氧化过程中所释放的自由能，将二磷酸腺苷(ADP)和无机磷酸转变为三磷酸腺苷(ATP)。线粒体至少具有70种以上的酶，这些酶按明确的顺序合理分布于线粒体的不同部位。这是生物学中结构与功能结合的一个突出实例。（摘自《线粒体医学与健康》）

OROBOROS O2k高分辨率细胞能量代谢分析系统

OROBOROS O2k系统通过高分辨率的Polarographic oxygen electrode和全功能的荧光技术实现对样本的线粒体呼吸功能以及生物体的能量代谢进行准确定量及分析。

O2k检测指标已经成为国际线粒体研究的标准，其应用范围几乎涉及所有与细胞或线粒体能量代谢相关的领域。

多功能参数检测：可同时检测pO2（耗氧率）、RCR（呼吸控制比率）、pH（产酸率）、MMP（线粒体膜电位）、ROS（活性氧）、ATP（三磷酸腺苷）、Ca2+（钙离子）、NO（一氧化氮）、H2S（硫化氢）、TPP+（四苯基膦）、NADH（辅酶Ⅰ）、CoQ（质体醌）、植物氧气释放速度等。

多种样品适用：可用于直接测量线粒体、原代细胞、传代细胞、组织器官、血液、微生物、植物细胞等。

核心主要性能特点：

双通道系统/多通道系统

测量样本容量0.5ml-3.5ml

温度范围：4-47℃，温度稳定性为±0.002℃，可进行低温试验、控温实验等

样本舱为杜兰玻璃材质，可反复利用，无使用耗材

配合样本舱的其他结构为钛金属等ji低活性的材质，提高材质抗氧化性，增加使用寿命

具有可变速的磁力搅拌功能，对脂肪细胞等脆弱样本，可降低搅拌速度，确保样本无损伤

Polarographic oxygen electrode传感器，耗氧率检测分辨率为1 pmol O2 · s-1 ∙ ml-1

耗氧率稳定状态下5分钟内变化不超过0.5 pmol · s-1· ml-1

光学（荧光、可见光）检测单元，与耗氧率同步进行检测，同时可得到多种参数数据

独立外接electrode单元：pH、H2O2、TPP+、H2S、NO、质体醌

荧光检测参数包括：MMP、ATP、Ca2+、ROS、NADH

检测参数可根据不同配置进行增配和减配，配置更灵活

具有标准曲线、单点、多点校准模式，其测量参数具有更高的可靠性

双通道微量注射泵，具有注射和回抽的功能，可编辑自动化控制

无限制加药次数，配有15种不同量程的微型加药针

专用组织匀浆工具，采用匀浆管技术对样本进行研磨，样本需求量少至几毫克

可特异性设计实验，根据实验设计实时加入不同的底物、inhibitor等化合物去改变线粒体的呼吸，可以加入20多种底物、inhibitor

强大的DatLab软件功能：可实时显示并记录所有测量参数；可在实验过程中随时更改实验设计；可自动进行耗氧率、光学等参数的校准

具有Protocol编程功能，支持客户自定义编程以便重复实验，同时厂家提供多种Protocol程序，方便客户选用

OROBOROS细胞能量代谢分析仪

产品型号：

O2k PhotoBiology（植物专用）

O2k系列

NextGen-O2k系列

应用方法（一）：

极谱氧电极高分辨率呼吸测量法评估细胞线粒体功能

关键词：活细胞、氧化压力测试、解偶联剂浓度逐级梯度滴加

该实验可得细胞的基础呼吸（Routine）、质子漏水平（Leak）、最大电子传递能力（ET）以及非线粒体耗氧（ROX）的数据；其中ET途径由于其解偶联剂的特殊理化性质，需多次滴加，试剂浓度逐级递增，直至出现最高的细胞耗氧率为止；本实验中，解偶联剂FCCP（U）以0.5 µM梯度加入，如图所示在5.5 µM时出现最大耗氧率，即此时为最大电子传递能力（ET）；该实验可了解细胞内线粒体的基础活性、最小耗氧能力、最大耗氧能力、能量储备能力以及非线粒体耗氧能力。

参考文献：Gnaiger (2008) Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. in: Mitochondrial Dysfunction in Drug-Induced Toxicity. John Wiley.

应用方法（二）：

极谱氧电极高分辨率呼吸测量法评估组织线粒体功能

关键词：活检肌肉组织、肌纤维透化、底物试剂无限制添加、高质量数据

实验样本为不同质量的人类股外侧肌组织，采用脂肪酸氧化（F），NADH途径（N）和琥珀酸途径（S）的底物的试剂滴加方案；将样本A 3.4mgWw组织与样本B 2.8mgWw 组织分别置于双通道的细胞代谢测量分析系统中，并分别加入苹果酸、辛酰肉碱、ADP、谷氨酸、琥珀酸、鱼藤酮、丙二酸、粘噻唑、以及抗霉素等，观察细胞的耗氧情况。红色曲线为样本A，绿色曲线为样本B，实验结果表明，活检肌纤维样本具有能量代谢测量的可操作性，且不同质量样本归一化结果具有可重复性。

参考文献： Pesta D, Gnaiger E (2012) High-resolution respirometry. OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibres from small biopisies of human muscle. Methods Mol Biol 810: 25-58.

应用方法（三）：

O2k光电联合同步检测线粒体耗氧率与H2O2

关键词：脑组织、线粒体、耗氧率、H2O2、实时同步检测

实验中分别添加丙酮酸、谷氨酸、ADP、琥铂酸、鱼藤酮、寡霉素、FCCP、抗霉素等，实验结果显示线粒体在底物型试剂添加过程中其耗氧率随底物的添加产生变化，而活性氧的变化不明显。当inhibitor添加之后，明显可见活性氧产生积累，进而影响耗氧率的变化情况。

应用方法（四）：

O2k光电联合同步检测线粒体耗氧率与线粒体膜电位

关键词：脑部、组织匀浆、耗氧率、线粒体膜电位、实时同步检测

实验使用小鼠脑部的新鲜组织匀浆液，通过O2k的oxygen electrode和荧光模块相结合，共同检测样本的耗氧率和线粒体膜电位（ Δψmt or mtMP ）；如图所示，两种不同的干预条件，即Mna（红色）和carrier（绿色），小鼠脑部组织匀浆液在磷酸化过程和耗氧率测量中均发生了明显的差异性，同时观察到线粒体膜电位（ Δψmt or mtMP ）发生同步变化。

参考文献：Krumschnabel G, Eigentler A, Fasching M, Gnaiger E (2014) Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol 542:163-81.

应用案例一：O2k 深度表征线粒体各复合体功能活性差异（癌症领域）

关键词：口腔鳞状细胞癌、天然产物药物、复合体IV

引言：恶性肿瘤是危害人们生命健康的重大疾病，抗肿瘤药物的研发任重而道远。化学合成的抗肿瘤药物在临床上虽然占据主要地位，但是随着人们越来越深刻地认识到它的毒副作用，从天然产物中寻找抗癌有效成分，已成为越来越多抗肿瘤药物相关工作者关注的。

摘要：Isoplumbagin (5-hydroxy-3-methyl-1,4-naphthoquinone)，一种天然存在的醌，具有抗炎和抗菌活性。长期以来，炎症一直与癌症进展相关。在这项研究中，作者研究了Isoplumbagin的抗癌作用机制。体内研究结果表明2 mg/kg Isoplumbagin对源自OSCC细胞的原位异种移植肿瘤(口腔颊)的生长有restrain作用。从机制上讲，Isoplumbagin通过降低癌细胞线粒体复合体IV活性，促进癌细胞发生凋亡，从而发挥其细胞毒性作用，起到抗癌的治疗效果。

结果：作者直接通过O2k进行检测研究了Isoplumbagin如何减少癌细胞线粒体 OXPHOS。Isoplumbagin癌细胞处理组与DMSO癌细胞对照组相比，以谷氨酸/苹果酸为底物的复合体I功能活性和以琥珀酸为底物的复合体II功能活性没有变化，但以四甲基对苯二胺（TMPD）/抗坏血酸为底物的癌细胞复合体IV的功能活性明显降低。综上所述，这些数据表明Isoplumbagin可通过restrain癌细胞线粒体复合体IV活性减少OXPHOS水平。值得注意的是，作者也尝试用另外一组药物处理方案，如图所示，分别添加Oligomycin、FCCP、Rotenone & Antimycin，做胞外呼吸能力测试，Isoplumbagin癌细胞处理组与DMSO癌细胞对照组相比，整体胞外呼吸能力有降低，但无法对癌细胞复合体IV功能活性是否存在显著性差异进行表征分析，无法进行更深入的机制研究。

参考文献：Tsao YC, et al. Discovery of Isoplumbagin as a Novel NQO1 Substrate and Anti-Cancer Quinone. Int J Mol Sci. 2020;21(12):4378. Published 2020 Jun 19. doi:10.3390/ijms21124378.

应用案例二：O2k能量代谢活检组织样本检测（癌症领域）

关键词：前列腺癌组织、线粒体、复合体I

引言：近年来，转化医学在肿瘤领域的应用越来越广泛。肿瘤临床样本作为肿瘤基础与临床研究的关键源头，如何用好这些肿瘤临床样本进行肿瘤相关突变基因筛选、肿瘤的发生、发展和转移机制的探究等工作，是实现“肿瘤转化医学研究”的重要保证。

摘要：文献报道了良性/恶性人类前列腺组织临床样本中，线粒体呼吸、DNA变异和基因表达的情况。研究发现，前列腺癌（PCa）组织中NADH途径底物谷氨酸和苹果酸盐的呼吸能力降低，代谢显著向更高的琥珀酸盐氧化代谢转变，尤其是在前列腺癌中更为明显。编码线粒体复合体I（CI）基因的高水平有害变异与NADH途径氧化能力降低和琥珀酸盐氧化增强（复合体II途径）补偿相关。这些结果表明琥珀酸盐作为“前列腺癌代谢物”的重要性。鉴于这些发现，琥珀酸盐和复合体II（CII）是新型有希望的抗前列腺癌的药物靶点。

结果：从50例前列腺癌根治术标本中每例提取成对良性/恶性组织穿刺针活检。O2k评估每个前列腺标本的成对良性/恶性组织活检的OXPHOS水平，并且用H2O2进行短期处理以模拟氧化应激。与PCa组织相比，良性组织显示出显着更高的NADH通路OXPHOS容量（电子通过CI进入Q），在进一步添加琥珀酸盐 (S) 后，没有观察到OXPHOS (NSP) 和ET (NSE) 呼吸能力的差异，表明通过琥珀酸盐途径的会将电子转移增加来补偿NADH途径缺陷（电子通过CII进入Q）。与相应的良性样本相比，含线粒体DNA突变的前列腺癌恶性组织样本显示非常低的NADH通路容量（P&G&M；丙酮酸&谷氨酸&苹果酸），其 NADH通路容量降低了>百分之70，对这些突变的结构分析显示，氨基酸的变异导致了对复合体I的潜在有害影响，并证明了存在因果关系。

参考文献：Schöpf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nat Commun 11, 1487 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-15237-5.

应用案例三：O2k能量代谢多参数检测（神经领域）

引言：膜内蛋白水解酶虽然曾经是一个有争议的概念，但却是一个广泛研究的领域。已经鉴定了四类膜内蛋白酶，并根据它们的肽键水解催化机制进行分类：金属蛋白酶、谷氨酰蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。这些类别中研究的一类是丝氨酸膜内蛋白酶的菱形超家族。在所有目前鉴定的菱形蛋白酶中，一种非常令人感兴趣的是哺乳动物线粒体菱形蛋白酶PARL（presenilin-associated rhomboid-like protein），其在维持神经系统稳态中的调节、活性和作用仍然需要很深入的探索。

案例7.1：《小鼠 PARL 缺乏会导致氧化磷酸化功能障碍和 Leigh 样综合征》

关键词：脑部、线粒体、突触体、复合体I、复合体II、复合体IV、ROS、Ca2+、膜电位

摘要：作者表明小鼠PARL敲除（Parl-/-）会导致类似于Leigh综合征的亚急性坏死性脑脊髓病,这是一种以能量产生中断为特征的线粒体脑肌病。Parl-/-脑线粒体受到进行性超微结构变化、氧化磷酸化功能障碍和线粒体钙代谢缺陷的影响。PARL在维持神经系统呼吸链中发挥着以前被忽视的组成性作用，其缺乏会导致进行性线粒体功能障碍和结构异常，从而导致神经元坏死和Leigh样综合征。

结果：电镜扫描了PARL 缺乏的线粒体超微结构，显示线粒体肿胀，嵴异常及消融；通过O2K耗氧率参数检测发现Parl-/-缺陷型脑线粒体氧化磷酸化和线粒体电子传递链受到很大的损伤，通过检测ROS，发现在复合体I有轻微的氧化应激，并且这种损伤通过检测Ca2+也发现线粒体对钙的吸收能力受到严重影响；又通过MMP（膜电位）参数检测发现在没有添加ADP的时候，MMP并没有显著差异，说明引起钙的吸收能力的影响因素很多，不一定是线粒体去ji化；添加ADP进行氧化磷酸化时，MMP有显著差异，说明线粒体整体功能确实受到了很大的影响。作者通过O2k多参数检测，从多个维度探索了线粒体在耗氧、ROS、MMP、Ca2+方面的差异，也反应这种线粒体内膜蛋白酶对维持线粒体氧化磷酸化、能量代谢等功能的稳态起到非常重要的作用。

参考文献：Spinazzi M, Radaelli E, et al. PARL deficiency in mouse causes Complex III defects, coenzyme Q depletion, and Leigh-like syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. 2019 Jan 2;116(1):277-286.

应用案例四：O2k 耗氧率与ROS 双参数实时动态同步检测（心血管领域）

关键词：心脏、线粒体、复合体I、ROS

引言：心肌缺血后再灌注损伤是指在短时间内心肌血供中断，一定时间内恢复血供后，原缺血心肌发生较缺血时更为严重的损伤。随着心脏外科体外循环、冠状动脉搭桥术、复杂先天性心脏病纠治术、瓣膜置换术及大血管外科手术等技术的推广应用，心肌缺血后再灌注损伤已成为影响心脏血管外科手术疗效的一大难题。研究表明，心肌缺血后再灌注损伤的发生可能与钙超载、氧自由基增多、心肌纤维能量代谢障碍等机制有关，但具体发病机制尚未得到阐明。

摘要：线粒体电子泄漏引起的活性氧的产生可能在很多生理或病理过程中都有参与。NDUFA 13是线粒体复合体I的辅助亚基，具有独特的分子结构。作者在研究中建立了心脏特异性NDUFA 13基因敲除杂合子小鼠。在基础状态下，NDUFA 13 的适度下调在复合体I内引起电子泄漏，导致轻度增加了细胞质局部的H2O2。由此产生的活性氧作为信使，负责STAT3的二聚化，激活了抗凋亡信号通路，显著restrain超氧化物爆发并减少了缺血再灌注过程中的梗死面积。

结果：通过O2k对新鲜分离的心脏线粒体进行线粒体呼吸功能分析。测定了复合体I、II、IV的氧消耗率（OCR）。数据表明，与 (Cre-flox/-)对照小鼠相比，(Cre+flox/-) NDUFA13 基因敲除小鼠中复合体I的底物驱动OCR降低，其他复合体OCR没有变化；表明建立了心脏特异性NDUFA13基因敲除小鼠模型；为了研究NDUFA13基因敲除导致ROS生成情况，作者用O2k同时测量OCR和H2O2水平。使用针对复合体I和复合体III的不同底物和阻断剂，作者证明了(Cre-flox/-)对照小鼠线粒体以琥珀酸为底物产生了大量H2O2，并且可以被鱼藤酮阻断；相反，(Cre+flox/-) NDUFA13 基因敲除小鼠则H2O2量很低。

参考文献：Hengxun Hu, et al. Electron leak from NDUFA13 within mitochondrial complex I attenuates ischemia-reperfusion injury via dimerized STAT3. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Nov 7;114(45):11908-11913.

应用案例五：NextGen O2k 三参数实时动态同步检测（氧化还原领域）

关键词：脯氨酸、耗氧率、NADH、CoQ氧化还原态、线粒体膜电位

引言：脯氨酸（Proline，Pro）是人体的非必需氨基酸，对稳定生物大分子结构、降低细胞酸性以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起重要作用。Pro被脯氨酸氧化酶（也称脯氨酸脱氢酶，ProDH）氧化为吡咯啉-5-羧酸（P5C）的过程中产生的电子转移至线粒体泛醌（CoQ），从而支持线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）。然而P5C的分解代谢依赖于氧化磷酸化复合体I（CI）活性，这是由于NAD+要求的。NextGen-O2k可以实时同步测量耗氧率、线粒体膜电位、NADH或CoQ氧化还原态，助利于多维度深入研究脯氨酸在能量代谢过程中的作用机制。

结果一：脯氨酸增加了肝脏和肾脏线粒体氧化磷酸化水平：

如下图，利用NextGen-O2k检测不同浓度Pro（0.25–10 mM）对小鼠肝脏和肾脏组织分离的线粒体耗氧率的影响，发现线粒体OXPHOS（氧化磷酸化）呈剂量依赖性增加，而存在谷氨酸（G）和苹果酸（M）以及添加分别β羟基丁酸（βOH）或衣康酸盐（Itac），线粒体OXPHOS在不同浓度Pro添加下的剂量依赖性变化消除。Gergely Pallag, et al. Proline Oxidation Supports Mitochondrial ATP Production When Complex I Is Inhibited. Int J Mol Sci. 2022, 23, 5111. https://doi.org/10.3390/ ijms23095111.

结果二：Pro增加了对耗氧率、线粒体膜电位和NADH的作用：

如下图A，Pro以不同浓度的剂量增加，逐渐引起线粒体膜电位极化；而进一步添加CI抑制剂Rot（图B）和CII抑制剂Atpenin A5（图C）并没有影响线粒体膜电位极化；当添加CIII抑制剂Myx时，完全抑制了Pro引起的线粒体膜电位极化；与线粒体膜电位数据检测一致，对线粒体实时同步检测耗氧率、NADH、Rhd123（线粒体膜电位），不同浓度Pro（0.25–5 mM）引起耗氧率（图F）、NADH（图G），线粒体膜电位极化（图H）呈现剂量依赖性增加，说明Pro支持OXPHOS。

结果三：ProDH抑制剂降低了CoQ还原态和耗氧率

如下图B和D，利用NextGen-O2k检测不同浓度ProDH抑制剂THFA（0.5–10 mM）对小鼠肝脏和肾脏组织分离的线粒体耗氧率的影响，发现线粒体OXPHOS呈剂量依赖性降低；利用NextGen-O2k对线粒体实时同步检测耗氧率（图F）、CoQ氧化还原态（图G）、Rhd123（线粒体膜电位）（图H），发现含有5 mM Pro的b相对于a或含不同浓度THFA的c、d、e，其耗氧率、CoQ还原态最高，而e则最低，说明Pro支持OXPHOS，而膜电位没有显著性的变化，说明Pro提供的电子都用于氧气的消耗。

结果四：Pro维持了ANT正常转运功能

如下图：腺苷酸转运蛋白（ANT）位于线粒体内膜上，正常状态下，ANT把ADP转运到线粒体基质，把ATP从线粒体基质中运出。利用NextGen-O2k对线粒体实时同步检测耗氧率（图A）、CoQ氧化还原态（图B）、Rhd123（线粒体膜电位）（图C），发现添加Pro与添加ANT抑制剂CAT两者数据相对比，Pro相对CAT增加了耗氧率、CoQ氧化态和线粒体膜电位去极化，维持了ANT正常转运功能。而CAT抑制了ANT的正常转运功能，显著增加了线粒体膜电位极化，耗氧率反而降低、CoQ还原态增加，说明细胞内产生了过量的电子，容易引起细胞发生氧化应激损伤。

参考文献：Gergely Pallag, et al. Proline Oxidation Supports Mitochondrial ATP Production When Complex I Is Inhibited. Int J Mol Sci. 2022, 23, 5111. https://doi.org/10.3390/ ijms23095111.

结果二

结果一

结果四

结果三

应用方法六（高原科学领域）：

高海拔低氧适应的代谢基础

关键词：高海拔、低氧、骨骼肌、活检肌肉组织、线粒体功能

尼泊尔夏尔巴人在ATP（三磷酸腺苷）的生产中表现出更高产出效率，即使他们在较低的海拔中开展工作，也能保持这种有效的能量产出效率。在夏尔巴人的骨骼肌活检中，在海拔1400米和5300米分别测量了组织纤维的呼吸作用，发现线粒体中基础代谢差异不大（A）、复合体II（琥铂酸S的作用，B）和TCA重构（GMS加入开启TCA，C）过程中，夏尔巴人具有明显的耗氧率低，脂肪酸的氧化分解能力较低（D），因此夏尔巴人可以更有效地利用氧气，改善肌肉的能量并防止氧化应激。高海拔低氧适应性能够更有效的支持肌肉运动。

Baseline：海拔1400米活检人肌肉组织

Altitude1: 海拔5300米短期适应活检肌肉组织

Altitude2: 海拔5300米长期适应活检肌肉组织。

参考文献：Souza da Silva J, Nonose Y, Rohden F, Lukasewicz Ferreira PC, Fontella FU, Rocha A, Wigner Brochier A, Vieira Apel R, de Lima TM, Seminotti B, Amaral AU, Galina A, Souza DO (2020) Guanosine neuroprotection of presynaptic mitochondrial calcium homeostasis in a mouse study with amyloid-β oligomers. Mol Neurobiol 57:4790-809.

应用方法七（骨骼肌领域）：

线粒体MDM2独立于p53调节复合体I的活性

关键词：骨骼肌匀浆液、线粒体功能、复合体I

MDM2是一种癌基因，MDM2的表达水平增强会提高癌细胞的迁移和侵袭特性，同时MDM2癌基因表达导致线粒体功能降低也有助于其致癌特性的提高；本实验中敲除MDM2基因（sh MDM2）后，可见线粒体功能有明显提高，并且主要实行功能的蛋白为线粒体内膜上的复合体I（CI），其他复合蛋白（CII、CIV）与正常细胞无明显差异；MDM2的另外两种处理方法分别为FL-MDM2（FLAG-tagged full-length (aa 1–491) MDM2）以及MTS-MDM2（mitochondrial targeting sequence MDM2），这两种MDM2处理方法对样本线粒体功能的影响同样集中于复合体I（CI），能量代谢检测中可见复合体I（CI）的功能明显弱于对照组（Empty），其他复合蛋白无明显差异；对小鼠骨骼肌匀浆液的能量代谢检测实验结果表明，骨骼肌中MDM2基因缺失会提高线粒体能力，降低致癌风险，增加复合体I（CI）活性和肌肉产能能力。

参考文献：Arena G, Cissé MY, Pyrdziak S, Chatre L, Riscal R, Fuentes M, Arnold JJ, Kastner M, Gayte L, Bertrand-Gaday C, Nay K, Angebault-Prouteau C, Murray K, Chabi B, Koechlin-Ramonatxo C, Orsetti B, Vincent C, Casas F, Marine JC, Etienne-Manneville S, Bernex F, Lombès A, Cameron CE, Dubouchaud H, Ricchetti M, Linares LK, Le Cam L (2018) Mitochondrial MDM2 regulates respiratory complex I activity independently of p53. Mol Cell 69:594-609.

应用方法八（骨骼肌领域）：

删除miR-1/133a会损害线粒体功能鸟

关键词：小鼠骨骼肌纯化线粒体、小鼠骨骼肌纤维

在分化的心肌细胞中，miR-1 / 133a基因表达会下调Mef2A，从而restrain了印记域Dlk1-Dio3的表达，该印记域能够编码多个restrain线粒体基因的蛋白。骨骼肌中miR-1 / 133a基因的缺失或者Mef2A的增加同样会导致印记域Dlk1-Dio3基因的表达连续增高，进而出现明显的线粒体功能障碍。实验结果表明，在小鼠骨骼肌线粒体（MSMM）的能量代谢测量中，发现dKO组和Mef2A组的复合蛋白物II的耗氧率要明显低于control组，说明miR-1/133a的敲除和Mef2A的含量增加对线粒体的功能损伤与复合蛋白物I的功能具有明显相关性；在小鼠肌纤维（EDL fibers）的测量中，dKO组的复合蛋白物I与control组相比出现了明显的降低， Mef2A组复合蛋白物I和复合蛋白物II的耗氧能力与control组相比都出现了明显降低，因此miR-1/133a的敲除和Mef2A的含量增加对线粒体的功能具有明显的损伤。

参考文献：Wüst S, Dröse S, Heidler J, Wittig I, Klockner I, Franko A, Bonke E, Günther S, Gärtner U, Boettger T, Braun T (2018) Metabolic maturation during muscle stem cell differentiation is achieved by miR-1/133a-mediated inhibition of the Dlk1-Dio3 mega gene cluster. Cell Metab 27:1026-39

应用方法九（植物领域）：

植物激素信号传导调控线粒体蛋白质稳态

关键词：暗呼吸检测；样本：拟南芥-叶片、线粒体

方法：

使用Oroboros O2k在24℃黑暗中测量叶片暗呼吸。

首先将来自拟南芥植物的叶盘悬浮在叶片呼吸缓冲液中，在黑暗中孵育30分钟，然后记录耗氧率。根据叶盘的鲜重归一化计算耗氧率。

使用Oroboros O2k在24℃在黑暗中对拟南芥植物叶片中分离的线粒体进行暗呼吸测定。在测量过程中，将线粒体蛋白悬浮在反应混合物中分别加入丙酮酸、谷氨酸、苹果酸、ADP和没食子酸正丙酯测量复合物I呼吸能力，然后加入琥珀酸盐测量总呼吸能力。

结果：

(A) mrpl1-1, mrpl1-3 (mitochondrial ribosomal protein L1, MRPL1) 是拟南介线粒体核糖体蛋白 L1突变体，与野生型相比，突变体叶片整体OCR显著降低；

(B) Dox是一种restrain线粒体蛋白翻译的霉素，野生型经Dox处理后，其线粒体整体OCR显著降低，复合物I呼吸能力也显著降低；

(C) ACC(乙烯前体)是由ACC合酶合成的非蛋白氨基酸，ACC经常被用来诱导乙烯响应，而乙烯restrain根的生长；Ag2+是乙烯inhibitor，分别用ACC和Ag2+处理野生型，只有通过ACC处理后的线粒体整体OCR显著升高，复合物I呼吸能力也显著升高。

结论：

拟南芥MRPL1 功能突变体实验（实验A）和Dox药物处理实验（实验Ｂ）引起线粒体翻译受损，降低复合物I呼吸能力和整体呼吸能力，乙烯能够通过其信号传导调控线粒体蛋白质稳态，提高复合物I呼吸能力和整体呼吸能力。

参考文献：Molecular cell | Systems Phytohormone Responses to Mitochondrial Proteotoxic Stress. 2017 Nov 2;68(3):540-551.e5.

应用方法十（植物领域）：

鸟苷维持突触体线粒体钙稳态并对神经具有保护作用

关键词：呼吸作用；样本：烟草叶、线粒体

方法：

使用Oroboros O2k对WT和P07（转基因AtUCP1高表达）植物的粗分离线粒体进行线粒体呼吸的测量。首先进行粗分离线粒体，然后将含有粗线粒体的沉淀重悬于洗涤缓冲液中。苹果酸和谷氨酸被用作呼吸的底物。添加ADP以测量ADP依赖性呼吸。寡霉素用作ATP合酶inhibitor来测量由于解偶联活性引起的耗氧量，化学离子载体羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙 (FCCP)(2μM) 用于测定耗氧量。

结果：

WT和P07植物烟草叶中分离的粗线粒体保留了它们的呼吸特性：与基础呼吸相比，ADP和FCCP可以有效地增加耗氧量。

结论：

AtUCP1过表达增加解偶联呼吸能力

参考文献：BMC Plant Biology | Systems Overexpression of UCP1 in tobacco induces mitochondrial biogenesis and amplifies a broad stress response