得克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心微生物学、免疫学和分子遗传学系Xiang, Yan教授课题组长期从事抗病毒免疫机制和病毒免疫逃逸策略的研究。近期该课题组发表了名为“Human SAMD9 is a poxvirus-activatable anticodon nuclease inhibiting codon-specific protein synthesis”的研究性论文。该论文通过前期研究发现，人类SAMD9 N端domain是一种抗密码子核酸酶（ACNase），可特异性切割苯丙氨酸tRNA（tRNA-Phe）被2′-O-甲基化修饰的摆动解码位点，进一步应用 tRNA-seq和 ribo-seq发现，这导致tRNA-Phe表达下调和密码子特异性核糖体暂停和压力应激信号传导。在细胞中，SMAD9的ACNase酶活性通常是潜伏状态，但在痘病毒感染或疾病状态下发生SMAD9突变时会被激活，揭示了tRNA-Phe耗竭可以作为抗病毒机制和SMAD9突变疾病的致病条件。

       该研究成果于2023年6月发表在学术期刊Science Advances(IF: 13.6)上（康成生物|数谱生物可提供文章所采用的tRNA-seq技术服务平台）。

研究背景

       tRNA是蛋白翻译元件的基本组成分子，tRNA运载氨基酸进入核糖体，其自身的反密码子（anticodon）通过序列互补配对识别mRNA上的三联密码子（codon），从而将mRNA上的蛋白编码序列解码，合成蛋白质。除此之外，它们也是微生物用来阻止病毒感染、减轻细胞应激或消除竞争生物的蛋白质毒素的主要靶标。作为针对病毒或竞争对手的防御策略，一些微生物使用抗密码子核酸酶（ACNase）来消耗必需的tRNA，它们在反密码子环处切割tRNA，导致细胞中特定tRNA的消耗和蛋白质合成中的阻断，从而有效地防止外源干扰对自身的影响。然而，在多细胞真核生物中尚未观察到这种机制。

       在脊椎动物中，干扰素调节的天然免疫系统是抵御病毒的第一道防线，干扰素刺激诱导产生的抗病毒因子可以作为病毒的抑制因子，阻止病毒的复制。例如哺乳动物干扰素刺激的产物SAMD9和SAMD9L是痘病毒VACV（包括猴痘病毒和牛痘病毒在内的DNA病毒家族）的有效抑制因子，但是具体的抑制机制并不完全清楚，本篇文章表明，SAMD9能够通过类ACNase的机制，切割细胞内特定的tRNA，从而达到抑制痘病毒复制的效果。

研究思路

      1. 前期实验：SMAD9具有ACNase活性

      文章前期实验通过人类全基因组 RNA 干扰筛选鉴定，并利用HeLa 细胞中的单个基因敲除证实，SAMD9、WDR6和 FTSJ1可以抑制VACV 突变体（不能产生宿主 SAMD9/9L 抑制分子）的生长。FTSJ1是甲基化转移酶，可以与WDR6互作，为tRNA的反密码子摆动解码位点34位碱基添加2’-O-me修饰。通过体外切割电泳迁移实验，结构解析等发现SMAD9的N端134-385位氨基酸具有ACNase活性，在野生型VACV感染的情况下被激活，可以结合具有2’-O-me修饰的tRNA并进行切割，导致tRNA表达降低。

      2. tRNA-seq和ribo-seq高通量筛选及验证

      为了全面评估SAMD9对细胞内tRNA的影响，文章使用改良的tRNA测序 筛选感染VACV的细胞中的tRNA水平。相对于感染野生型 VACV的细胞，突变型VACA感染的细胞，具有34位2’-O-me修饰的tRNA-Phe表达水平显著降低了近10倍，但其他tRNA则没有明显的变化。文章进而利用 Ribo-seq来探究tRNA-Phe的耗竭是否影响了核糖体在tRNA-Phe解码的密码子处的停滞及整体蛋白合成，发现相对于感染野生型VACV的细胞，突变型VACA感染的细胞在解码Phe的密码子位置的reads密度明显增加，说明由于突变型VACA无法抑制SMAD9。因而激活的SMAD9可以切割tRNA-Phe，tRNA耗竭导致了Phe密码子处的核糖体停滞。多柔比星Dox可以诱导野生型SMAD9表达，利用 Ribo-seq筛选和Northern blot验证探究了过表达R1293W 突变型SAMD9（无切割活性）的BT20细胞在Dox诱导前后的变化，也发现了Dox诱导激活了野生型SMAD9切割tRNA，tRNA耗竭导致了Phe密码子处核糖体停滞。

      3. 功能机制实验：活化的SAMD9触发核糖毒性应激，影响整体蛋白合成

      为了找出SAMD9激活下游通路基因，文章对感染野生型VACV前后、感染突变型VACA前后的HeLa细胞进行了转录组分析，并将其与过表达R1293W 突变型SAMD9的Dox处理前后的Hela细胞转录组差异基因取交集，发现有9个基因是感染野生型VACV后下调，感染突变型VACA及过表达R1293W 突变型SAMD9的Dox处理后hela细胞上调的，其中ATF3变化超过60倍，qPCR验证趋势相符，同时作者也观察到了eIF2α磷酸化的现象。由于ATF3表达升高以及eIF2α磷酸化是核糖体碰撞和随后的核糖毒性应激的特征，因此作者认为活化的SAMD9能够导致持续的核糖体停滞，进而引发核糖体碰撞和随后的核糖毒性应激，从而抑制蛋白合成与病毒的复制。进一步作者通过tRNA Phe的敲低及过表达实验证明SAMD9是通过切割tRNA Phe来发挥上述功能的。

技术路线

结果展示

      1.tRNA-seq和ribo-seq高通量筛选

      图1. A. tRNA测序筛选突变vs野生型VACV感染前后差异的tRNA, tRNA-Phe-GAA在突变VACV感染后下调显著；
      B. Ribo-seq筛选突变vs野生型VACV感染前后解码不同氨基酸的密码子处的read密度，tRNA-Phe解码的UUU和UUC密码子上调显著，说明在此处发生了明显的核糖体停滞。

      2.功能机制实验：活化的SAMD9触发核糖毒性应激，影响整体蛋白合成

      图2. 功能机制实验：活化的SAMD9触发核糖毒性应激，影响整体蛋白合成
      A.转录组测序筛选感染野生型VACV前后、感染突变性VACA前后、过表达R1293W 突变型SAMD9的Dox处理前后的细胞中差异基因，获得9个SMAD9下游调控的候选基因；
      B. Northern blot显示，感染突变型VACA后，病毒无法抑制SMAD9，切割tRNA-Phe导致其表达下调，ATF3激活；
      C.相对于wt SMAD9， 过表达R1297W突变型SMAD9，Dox诱导后细胞ATF3 表达增加，eIF2α磷酸化增加；
      D. 流式细胞实验证明，293T细胞转染mCherry-SAMD9 R982C融合蛋白，相对于未转入细胞的新生蛋白质合成水平显著降低，加入tRNA-Phe则明显回复。

研究意义

      文章发现SMAD9在突变型VACV感染后，可以激活ACNase活性，结合具有2’-O-me修饰的tRNA并进行切割，导致tRNA表达降低；但感染野生型VACV，病毒可以产生SMAD9抑制剂，抵抗tRNA切割。作者后续通过 tRNA测序和Ribo-seq进行筛选，找到了受SMAD9调控的靶tRNA-Phe，tRNA-Phe的耗竭导致核糖体在tRNA-Phe解码的密码子UUU和UUC处发生停滞。功能机制研究发现，活化的SAMD9切割tRNA-Phe导致其表达下调，激活ATF3和eIF2a磷酸化，触发核糖毒性应激反应，影响整体蛋白合成，进而抵抗病毒的感染。总体而言，这项工作思路清晰，数据详实，具有很高的科研价值与应用价值，为tRNA剪切和修饰的研究提供了新的思路与方法。

原文出处

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adh8502?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed