定量PCR，从理论到实践，从入门到精通（二）
——反转录相关

Real Time PCR，即实时荧光定量PCR，也被称为定量PCR或qPCR，是实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法。
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一般进行定量PCR的目的，是为了进行mRNA的表达量分析，或者对RNA拷贝数进行定量，或者确定RNA病毒是否存在的定性分析，那么首先都需要进行反转录实验，将RNA反转录为cDNA。

本文为您介绍反转录实验相关的一些基础概念。

◆ RNA模板制备

【RNA操作的注意】
制备RNA的关键，一是要抑制细胞中的RNA分解酶，二是要防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。
在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。

【使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前进行干热灭菌（180℃，60 min）或使用DEPC水处理再高压灭菌。

RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】 用于RNA实验的试剂，需使用RNA实验用的一次性塑料容器盛装，或使用上面方法处理过的玻璃容器盛装。使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【RNA模板的质量】
RNA的纯度会影响cDNA的合成量，所以在提取RNA后需要进行RNA纯度和质量检测。

吸光度测定方法

260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。
OD₂₆₀/OD₂₈₀（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.0之间。当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。

在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TE Buffer。

根据OD₂₆₀，可以计算提取的RNA浓度：
RNA浓度 (µg/µL） = (A₂₆₀-A₃₂₀）×稀释倍数×0.04

凝胶电泳方法 利用1%的琼脂糖凝胶（含溴乙锭）电泳结果，对提取的Total RNA进行RNA完整性以及是否有基因组DNA污染的评价。 如果可以清晰观察到两条rRNA条带（真核生物：28S和18S；原核生物：23S和16S），且其浓度比值大约为2:1，则RNA未降解。 若观察到smear现象，则RNA已发生降解。 如果观察到大于28S或23S的条带，则样品可能有基因组DNA污染，这时可以考虑使用DNase I处理。

使用Agilent 2100 BioAnalyzer进行检测
本方法基于微流体技术，仅需要2–7 ng RNA用于分析，可以替代传统的基于凝胶的分析方法。通过RNA Integrity Number (RIN)评估RNA样品的完整性。除了评价RNA质量外，这个自动化系统还可以很好地提供RNA浓度的估计值。

◆ 反转录引物

【反转录引物的选择】

进行Two Step RT-PCR反应时的反转录Primer，可使用Random Primer、Oligo dT Primer或Gene Specific Primer三种引物，它们与RNA模板互补结合的位置关系如图所示，我们必须根据实验目的区分使用。

【RNA模板中混入基因组DNA的处理】 
提取的Total RNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为PCR模板进行扩增，造成解析结果不准确。
为了避免这种情况发生，我们可以采取两种措施：① 引物设计时避免基因组DNA扩增；② 使用DNase I 处理除去基因组DNA。

首先确认目的基因的基因组结构，选择跨越较长的内含子。然后，在这个内含子两侧的外显子上分别设计上、下游引物。
Real Time PCR反应时通常扩增的目的DNA片段长度都比较短，设置的条件也是适合短片段DNA的扩增，超过500 bp就很难扩增了。所以，当内含子足够长时，基因组DNA来源的扩增就不能发生。

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