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定量PCR,从理论到实践,从入门到精通(一)
——基础概念篇


Real Time PCR,即实时荧光定量PCR,也被称为定量PCR或qPCR,是实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法。
由于定量PCR具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点,被广泛应用于医学检测、药物疗效考核、基因表达研究、转基因研究、基因检测、病原体检测、动植物检测、食品检测等各种领域。
所以,无论您从事生命科学的基础研究,还是制药企业、畜牧养殖企业、食品企业的从业人员,乃至出入境检验检疫局、环境监测部门、医院等单位的员工,都会或多或少地接触到或者需要了解掌握定量PCR的知识。



Real Time PCR的原理

Real Time PCR,是在PCR反应体系中加入荧光物质,并通过定量PCR仪器,对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测,最终对实验数据进行分析处理的方法。

【扩增曲线】即描述PCR动态进程的曲线。PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线,而是S形曲线(见下图)。

【扩增曲线的平台期】随着PCR循环数的增加,DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭、反应副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因,致使PCR并非一直呈指数扩增,而最终将进入平台期。

由于影响PCR扩增的因素错综复杂,因此每次PCR扩增时进入平台期的时机及信号高低变化很大,很难准确控制。

【扩增曲线的指数增长区】下图是同一样品重复进行96次Real Time PCR扩增时的实时监测结果,从这张图上我们可以看出,尽管平台期的变化很大,但在扩增曲线的指数增长区的某一区域,重复性非常好,这对PCR的定量分析非常重要。

【阈值和Ct值】我们在扩增曲线的指数增长区适当位置设定荧光检出界限值,即阈值(Threshold)。阈值与扩增曲线的交点就是Ct值,也就是Ct值是指达到阈值时的循环圈数(Threshold Cycle)。

下图清晰地显示了阈值线与扩增曲线、阈值与Ct值之间的关系。

【如何定量?】
经数学理论证明,Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系。Real Time PCR实时监控PCR扩增产物,在指数扩增期进行定量。
PCR每进行1个循环,DNA呈2倍的指数关系增长,不久达到平台期。

假设起始DNA的量为A0,经过了n个循环后,理论上DNA产物的量可以表示为:

An=A0×2n

那么,起始DNA量A0越多,扩增产物的量便越早达到检出值An,达到An时的循环圈数即Ct值。也就是起始DNA量A0越多,扩增曲线越早起峰,对应需要的循环圈数n越小。

我们将已知浓度的标准品进行梯度稀释,作为模板进行Real Time PCR,就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。根据Ct值与起始模板数的对数值之间的线性关系,就可以制作出【标准曲线】

未知浓度的样品的Ct值代入标准曲线,就可以求出未知浓度样品的起始模板量,这就是Real Time PCR的定量原理。



Real Time PCR的检测方法

Real Time PCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光检出方法可分为荧光染料嵌合法荧光探针法两大种类。

【荧光染料嵌合法的原理】


荧光染料,如TB Green®,可以与PCR体系中的双链DNA非特异性结合,结合后会发出荧光。
随着PCR循环圈数的增加,反应体系中的荧光强度呈指数增加。通过检测荧光强度,可以实时监测反应体系中的DNA扩增量,进而反推算样本中的起始模板量。

【荧光探针法的原理】

荧光探针是5'端带有荧光基团,3'端带有淬灭基团的一段核酸序列,可以与模板特异性结合。当探针完整时,荧光基团发射的荧光被淬灭基团淬灭,不能发出荧光。而当探针被分解后,荧光物质会游离出来,发出荧光。

PCR反应液中加入了荧光探针,在退火过程中,荧光探针便会和模板的特异位置结合。延伸过程中,PCR酶的5'→3'外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针,荧光物质游离处理,发出荧光。通过检测反应体系中探针的荧光强度,可以达到监测PCR产物扩增量的目的。

【荧光检测方法的选择】
如果用于区别同源性高的序列,以及进行SNP分型解析等多重PCR检测,荧光探针法无可替代。
而进行除此之外的Real Time PCR实验,我们推荐使用简单易行、成本低的荧光嵌合法。

染料法 探针法
优点 简单易行,成本较低,无需合成特异性探针 特异性强,能进行多重PCR。
缺点 对扩增的特异性要求高;不能进行多重PCR 需要设计特异性探针,成本较高;有时探针设计困难。

 

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