In-Fusion Cloning，让困难的克隆变得简单又有趣

       克隆，把不同的DNA片段拼接在一起，得到理想的重组载体，就像把契合的拼图拼在了一起，得到了最终完美的图案。
而克隆实验，是否能像拼图游戏一样有趣，取决于是否选择了一个合理、高效的方法。
       In-Fusion无缝克隆方法不受传统克隆方法的限制，无论载体类型或插入片段组成如何，针对各种克隆应用都能保持出色的准确性。甚至插入片段大小或片段数量增加，克隆成功率仍然很高。
       看看下面真实的客户实验例，了解科学家是如何利用In-Fusion HD Cloning把克隆这个“游戏”变得更有趣。

In-Fusion: 成功地直接克隆大的表达载体
数据提供： Ansul Lokdarshi Graduate Research Assistant, University of Knoxville, TN

· 实验介绍
       下面实验中使用了In-Fusion Cloning构建植物YFP标签蛋白质定位研究的正对照载体。无需传统连接方法的亚克隆操作，我们直接将黄色荧光蛋白质（YFP）克隆到一个植物双向载体上，启动子为花椰菜花叶病毒双35S启动子（CaMV D35S）。通过限制酶酶切作图和测序来筛选确认阳性克隆。

       从实验设计到完成、确认克隆，整体时间比连接酶的方法少了两天。

· 实验结果
       PCR扩增获得包含目标载体5’和3’末端序列的插入片段，PCR 生成了一个单一的清晰的正确大小条带（下图左侧）。利用 In-Fusion酶将插入片段克隆到线性表达载体上，检测3个克隆均为阳性克隆，对其中一个克隆通过限制酶作图确认（下图右侧）。最终构建的质粒长度约9.5 kb，一次克隆实验即成功了。

· 结论
仅通过一次克隆实验，即完成了阳性表达载体的构建，达到了 100%的成功率。不需要亚克隆，从实验设计到完成确认比传统连接酶的方法减少了两天。

（图片来源于Takara Bio USA, Inc.）

In-Fusion: 简单的多片段克隆解决一个合成的难题
数据提供： Christian Joerg Braun Postdoc, MIT

· 实验介绍
在该研究中，使用In-Fusion克隆将转录激活结构域的多个重叠片段快速克隆到Cas9-dead病毒表达载体中。插入该结构域的目的是改善转录基因激活的量。由于激活结构域的二级结构，无法直接合成整个序列，并且如果使用传统的基于连接酶的方法以多个片段构建该结构域又没有合适的限制酶位点。相反，应用In-Fusion技术可以该结构域的两段序列合成后在一个反应中完成克隆，无需担心限制酶位点的兼容性。将全长序列无缝克隆到表达载体中，通过限制酶消化和Sanger测序鉴定阳性克隆。
最终载体构建在三天内完成，手动操作时间总计仅两个多小时。

· 实验结果
通过单酶切将准备好的Cas9表达构建体线性化并凝胶纯化。设计两个合成的插入片段，使片段末端之间以及和载体末端带有重叠的区域。将两个插入片段同时克隆到线性化的表达载体中，并用该反应液转化附带的感受态细胞。通过限制酶消化进行菌落筛选，并通过测序进一步确认阳性克隆。在筛选的9个菌落中，6个显示正确的酶切结果（下图）和测序结果。

· 结论
利用In-Fusion技术，仅通过一个克隆反应就将两个合成的转录激活结构域克隆到Cas9表达载体中，成功率为～67％。In-Fusion Cloning能够在三天内生成最终的阳性克隆，无需被限制酶位点或后续的一系列克隆反应所困扰。

（图片来源于Takara Bio USA, Inc.）

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In-Fusion克隆

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