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大规模互作蛋白质筛选与快速验证解决方案

——教您如何在蛋白质汪洋中找出具有相互作用的蛋白质

      蛋白质在功能上的作用不是单个蛋白质孤立完成的，而是通过与其他蛋白质相互作用来完成的。在时间上，一个蛋白质可能需要顺序性地与多个蛋白质相互作用；在空间上，一个蛋白质可能与其他若干个蛋白质组装成为复合体执行功能。因此，鉴别蛋白质相互作用是研究蛋白质功能的基础性工作。 

      在相互作用持续时间上，蛋白质相互作用可以是持久性的也可以是短暂的，比如负责基因信息维护的酶很多是持久性地结合，比如在代谢过程中一些酶的相互作用就是相对瞬时性的；在相互作用的结合强度上，蛋白质相互作用可以是结合力强的，也可以是弱结合力的；有些方法是在体外进行判定（in vitro analysis），而有些方法是体内判定(in vivo analysis)。 因此，研究蛋白质相互作用往往需要配合使用若干种方法。

蛋白质相互作用的常规研究方法

常规方法 适合进行研究的相互作用
相互作用持续时间 相互作用强度 体内判定/体外判定
酵母杂交 持久或瞬时 强或弱 体内
免疫共沉淀 持久 强 体内
Pulldown 持久 强 体外
蛋白质交联（cross linking） 瞬时 弱 体外

【酵母双杂交技术】
      酵母双杂交技术是由Fields和Song在1989年提出的。该技术的产生是基于对酵母细胞的转录因子GAL4性质的研究。转录因子GAL4包括两个结构域，分别是位于N端的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端的转录激活域（Activati on domain，AD)。DNA-BD能够识别并结合于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)。而AD则是通过与转录机构（transcriptionmachinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。当DNA-BD和AD分开独立存在时，并不能激活转录反应，只有当二者在空间距离非常接近时，才会呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质的基因构建在同一个表达载体上，所获得的融合蛋白质叫做诱饵蛋白质（bait）；将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在另一个表达载体上，所得到的融合蛋白质叫做猎物蛋白质（prey）。Bait和prey发生相互作用，形成完整的转录因子GAL4，使酵母菌基因组的效应基因表达。

技术优点：
  1. 蛋白质相互作用发生在细胞内，蛋白质无需纯化，并且可以在一定程度上代表细胞内的真实情况；
  2. 适于大规模筛选，用已知的蛋白质从cDNA文库中调取具有相互作用的蛋白质；
  3. 可以检测出存在于蛋白质之间的微弱的或瞬时的相互作用。

技术局限性：

      假阳性：假阳性是指两个待测蛋白质本没有相互作用，但实验却显示阳性结果。例如，由于某些蛋白质本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白质在无特异激活结构域的情况下就可以激活效应基因转录。另外，某些蛋白质表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白质形成稳定的复合物从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。

【免疫共沉淀技术】
      免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。传统的Co-IP方法通常是用能够与琼脂糖珠上偶联的protein A特异性结合的抗体免疫沉淀A蛋白质，那么与A蛋白质在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来，以此来验证预测的蛋白质是否具有相互作用。

技术优点：
  1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；
  2. 与酵母杂交技术相同，蛋白质的相互作用是在细胞内进行的，避免外界环境影响；
  3. 实验流程比酵母杂交的方法要简单快速；
技术局限性：
  1. 灵敏度要比酵母杂交方法低，可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；
  2. 必须在实验前对互作蛋白质进行预测，以选择最后检测的抗体，所以若预测不正确，实验就得不到结果；
  3. 筛选效率低，无法像酵母双杂交的方法一样从大量的未知的蛋白质中调出具有相互作用的蛋白质。
      Clontech品牌的两款技术领先型产品，结合各自的优势特点并互补不足之处，为研究强度较大的蛋白质相互作用提供了文库级别的筛选和鉴别验证的可靠解决方案。首先，酵母杂交产品线Matchmaker系列，可以用于体内大规模的初步筛选蛋白质相互作用候选目标。其次，Clontech品牌特有的Capturem™技术，实现了基于膜上的蛋白质捕获，从而使得免疫共沉淀纯化部分的操作时间从传统的数个小时减少到5分钟左右，使实验效率显著提高。

实验流程示意图：

 

1. 自己构建酵母双杂交文库

      DIY文库，简便而且快速。
      您可使用Make Your Own Mate & Plate Library System（630490）自己制作文库。利用该系统，一周之内即可构建足够用于数百次酵母双杂交筛选实验的所需文库。文库构建是在Y187文库酵母菌株中通过酵母高效的同源重组机制直接完成的，无需进行传统文库构建过程中的一些繁冗的操作 (比如文库克隆、扩增和大肠杆菌收集等)。

技术原理

      本系统利用Clontech品牌的SMART cDNA合成技术，使用任意组织来源的少至100 ng的总RNA，即可构建cDNA文库。SMART技术利用了MMLV (Moloney murine leukemia virus) RT的末端转移酶活性和模板转换机制，合成的一链cDNA序列末端含有已知的通用引物结合位点。因此，SMART一链cDNA可以通过PCR进行扩增，然后与具有末端同源序列的Matchmaker Gold 猎物载体pGADT7-Rec进行重组。基于以上特征，使用纳克级的RNA (例如来源于显微解剖组织、激光捕获细胞或者活检样品) 即可合成cDNA，共转化这些cDNA和pGADT7-Rec到酵母菌株Y187中，即可直接构建文库。

Make Your Own "Mate & Plate"™ Library System（630490）制品特点
  • 利用SMART™技术在酵母中直接构建文库
  • 无需繁琐的克隆或文库扩增
  • 足够用于数百次的双杂交筛选
2. 文库蛋白质筛选方法
      Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System（630489）
      Matchmaker Gold酵母双杂交系统是酵母双杂交实验进行大规模文库蛋白质筛选方法的核心工具，系统中包含专门用于酵母双杂交实验的工程菌株Y2H Gold，具有更加严谨的筛选报告基因；采用巧妙的设计将诱饵蛋白质与文库蛋白质构建到不同类型的酵母菌中，利用酵母菌接合反应实现文库筛选，方便于在百万级别的文库中调取互作蛋白质，实现真正意义上的大规模的互作蛋白质筛选。

Matchmaker酵母双杂交系统的功能
  • 发现新的与已知蛋白质互作的蛋白质
  • 确认两个蛋白质之间的相互作用
  • 鉴定参与蛋白质相互作用的区域
技术原理：
      在基于GAL4的Matchmaker酵母双杂研究中，bait蛋白质与GAL4的DNA结合域（BD）融合表达，而作为文库的prey蛋白质与GAL4的激活结构域（AD）融合表达。当bait蛋白质与库（prey）蛋白质有相互作用时，DNA-BD与AD之间相互接近从而激活4个相互独立的报告基因（AUR1-C、 ADE2、HIS3和 MEL1）的表达。

       4个报告基因：Matchmaker Gold双杂交系统采用1个AbA抗生素筛选报告基因、2个营养筛选报告基因、1个蓝白斑筛选报告基因。

      当酵母双杂系统只采用HIS3营养报告基因筛选蛋白质-蛋白质互作时，经常会获得大量的背景克隆和假阳性。背景克隆是由于营养报告基因泄露表达引起的，而假阳性是由于prey蛋白质无需与bait蛋白质互作即可识别和结合报告基因上游序列引起的。

      Matchmaker Gold系统是采用4个报告基因/3个不同bait识别序列的双杂交系统。该系统采用新型的、稳定的酵母菌抗生素AbA，可以有效杀死非抗性克隆，从而大大降低了背景克隆的生长。4种报告基因同时作用，假阳性出现的概率大大降低。

Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System（630489）制品特点
  • 较低的假阳性率
  • 4个报告基因，包括Aureobasidin A（AbA）抗生素抗性筛选基因
  • 简便的“Mating”接合方法
3. 应用高效的Capturem™膜技术对蛋白质相互作用进行 Co-IP验证
      Capturem™IP & Co-IP Kit（635721）
      Capturem™ IP & Co-IP Kit（635721）制品特点
  • 简单和快速的实验流程：抗体与样品孵育，之后在室温下进行的纯化仅需5 min
  • 完整的解决方案：kit中包含用于IP和Co-IP实验的Capturem™ Protein A纯化柱和buffer，且均经过优化 
  • 高浓度：洗脱液体积小，产物浓度高
  • 高质量：样品在膜上停留时间短，避免复合物的凝集、解体或失活
  • 通用性强：兼容宽泛的IP buffer和实验条件
  • 一次性使用：基于新型膜技术的一次性离心柱，能避免污染
Capturem™ 方法Co-IP实验技术流程：

       从流程图中可以看出，抗体与蛋白质裂解液孵育后，从上样到洗脱纯化，仅需5 min就可以得到高质量的抗体-蛋白质-蛋白质复合物。由于样品在Capturem™膜上停留的时间短，所以可以很大程度地避免了复合物的凝集、解体或失活，从而提高验证实验的成功率。

      需要注意的是，如果没有合适的与天然蛋白质结合的抗体，可以考虑为目标蛋白质添加标签，如Myc、HA、Flag等，之后采用标签对应的抗体进行Co-IP实验。由于这些标签分子量都很小，所以一般不会对蛋白质的功能产生影响。Clontech品牌提供多种标签蛋白质表达载体和相应的标签抗体，可以满足您在实验上的多种需求。  

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