Guide-it™长ssDNA制备系统
实现更特异、更高效的基因敲入（knockin）！

       CRISPR/Cas9和其它基因编辑工具已经被成功应用于获得基因敲除突变（knockout），但众多事实证明在基因敲入上的应用有很大的难度。基因敲入所面临的主要难题是修复模板的制备和如何与Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物共导入至细胞。虽然单链DNA（ssDNA）修复模板展示出了优于双链DNA（dsDNA）模板的众多优势，但是其制备难度和制备费用都有很大的挑战性，因而限制了长单链DNA（long ssDNA）模板的应用。

以单链DNA作为修复模板的优势：

• 显著降低基因组随机整合的概率，提高基因编辑效率
• 导入ssDNA模板所产生的细胞毒性低
• 未整合的模板不能正常表达，这样更容易识别筛选目的细胞克隆

Guide-it长单链DNA制备系统

       Takara Bio公司旗下品牌Clontech所推出的Guide-it长单链DNA制备系统可以很好地解决长单链DNA的制备难题，本试剂盒可制备长达5 kb的ssDNA寡核苷酸，应用于CRISPR/Cas9或者其它基因编辑技术作为基因敲入实验修复模板，可实现更特异、更高效的基因敲入（knockins），有效提高CRISPR/Cas9长链DNA敲入效率。本试剂盒提供了一种简便的方法通过有选择地消化降解双链DNA PCR产物的正义链（sense strand）或者反义链（antisense strand），将其转化为单链DNA。本试剂盒提供了可以制备50条ssDNA链的足量试剂（25对正义链和反义链）。

Guide-it长单链DNA制备系统推荐应用
       若您的实验中遇到以下问题推荐：荧光标记、LoxP位点、表达框、启动子、SNPs、抑制子、长链DNA敲入效率低，采用本系统可有效提高您的实验效率！

简便的操作流程，易于上手
        第一步，通过合适的方法（克隆，融合PCR等）制作dsDNA起始模板，dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂，模板中间是欲knockin的外源序列。第二步，通过在第一步中产生的dsDNA的不同位置上结合磷酸化的引物，制备出两种不同的dsDNA作为Strandase反应的底物。添加Strandase Mix A，开始消化降解正义链或反义链（Strandase Mix A有选择性地降解磷酸化的DNA链）。第三步，添加Strandase Mix B完成降解反应，从而获得ssDNA。最后，纯化ssDNA产物用于knockin实验。我们建议制备ssDNA正义链和ssDNA反义链并独立用于knockin实验。

应用案例：荧光标记HEK293细胞内源性GAPDH基因
        本实验展示了使用ssDNA在细胞內源性蛋白中嵌入荧光蛋白质标签。所设计的HDR供体模板的同源臂序列为GAPDH外显子8的末端序列，AcGFP1与GAPDH处于同一阅读框（图A）。通过流式细胞术比较分析以dsDNA和ssDNA分别作为修复模板的实验结果（图B）。结果显示，当以dsDNA作为修复模板时，即使没有Cas9 RNPs，仍然出现相当多的带有绿色荧光的细胞克隆。当以长ssDNA正义链或者反义链作为修复模板时，只有同时加入Cas9和sgRNA，才会发生整合反应；而当没有Cas9 RNPs时，则没有检测到荧光背景，说明不发生整合反应。

（以上实验结论和图片来源于Takara Bio USA, Inc.）