实现特异、高效的 基因敲入（knockins）！
有效提高CRISPR/Cas9长链DNA敲入效率！

· 制备长达5 kb的长单链DNA（ssDNA）供体模板
· 三步操作，简便快速
· 不存在随机整合或者表达，提高了基因编辑效率
· 单链DNA（ssDNA）供体模板对细胞的毒性要远低于双链DNA（dsDNA）模板

       CRISPR/Cas9和其它基因编辑工具已经被成功应用于获得基因敲除突变（knockout），但众多事实证明在基因敲入上的应用有很大的难度。基因敲入所面临的主要难题是修复模板的制备和如何与Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物共导入至细胞。虽然单链DNA（ssDNA）修复模板展示出了优于双链DNA（dsDNA）模板的众多优势，但是其制备难度和制备费用都有很大的挑战性，因而限制了长单链DNA（long ssDNA）模板的应用。Guide-it Long ssDNA Strandase Kit可以很好地解决这个矛盾，可制备长达5 kb的ssDNA寡核苷酸，应用于CRISPR/Cas9或者其它基因编辑技术作为基因敲入实验修复模板。本试剂盒提供了一种简便的方法通过有选择地消化降解双链DNA PCR产物的正义链（sense strand）或者反义链（antisense strand），将其转化为单链DNA。该试剂盒提供了可以制备50条ssDNA链的足量试剂（25对正义链和反义链）。

★ 以单链DNA作为修复模板的优势：

• 显著降低基因组随机整合的概率，提高基因编辑效率
• 导入ssDNA模板所产生的细胞毒性低
• 未整合的模板不能正常表达，这样更容易识别筛选目的细胞克隆

       若您的实验中遇到以下问题推荐：荧光标记、LoxP位点、表达框、启动子、SNPs、抑制子、长链DNA、敲入效率低，采用本系统可有效提高您的实验效率！

■ 操作流程概览

（图片来源于Takara Bio USA, Inc.）

同源定向修复（Homology Directed Repair）实验用长单链DNA（long ssDNA）供体模板制备步骤示意图。
第一步，通过合适的方法（克隆，融合PCR等）制作dsDNA起始模板，dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂，模板中间是欲knockin的外源序列。
第二步，通过在第一步中产生的dsDNA的不同位置上结合磷酸化的引物，制备出两种不同的dsDNA作为Strandase反应的底物。添加Strandase Mix A，开始消化降解正义链或反义链（Strandase Mix A有选择性地降解磷酸化的DNA链）。
第三步，添加Strandase Mix B完成降解反应，从而获得ssDNA。最后，纯化ssDNA产物用于knockin实验。我们建议制备ssDNA正义链和ssDNA反义链并独立用于knockin实验。