环形RNA是mRNA在剪接的过程中，上游exon的5’端与下游exon的3’端剪接到一起，从而形成的首尾相接的环状RNA分子。 近来的研究表明，高等动物中环状RNA的种类和含量远远超过预期。最近的研究发现circularRNA可以作为“microRNA海绵”，竞争结合microRNA从而解除这些microRNA对其他靶标的调控；同时保守型分析发现环状RNA上潜在具有多种RNA结合蛋白的结合位点，暗示circular RNA可以调控RNA结合蛋白的功能。更为重要的是，circular RNA的表达呈现出很强的组织特异性，暗示这些circular RNA具有重要的生物学功能。但目前对circular RNA的研究刚刚起步，这类RNA的生物学功能还有待挖掘，因此是一个值得深入的研究方向。

环状RNA特点

1. 大多存在于细胞质中，且序列高度保守； 
2. 一般细胞或组织中，环状RNA较稳定，半衰期在48h，其他mRNA（线性）半衰期约为10h；血清中的外显子环状RNA不稳定，半衰期<15s。 
3. 不同细胞中表达的环状RNA可能不同； 
4. 同一个基因可能即产生线性mRNA，又可以转录成环状RNA;
5. 总量估计，外显子环状RNA（exonic circRNA）的量约为polyA mRNA（线性mRNA）的1%；占所有非核糖体RNA的0.8%； 
6. 大部分为ncRNA。 

样本要求

• 样本类型：细胞、新鲜组织或足量total RNA
• 样品量：≥5ug纯化后的total RNA（需保证提供的细胞及组织样本可以提取到足量RNA），最低浓度不低于50ng/µl
• 样本质量：OD 260/280值应在1.9～2.2 之间；DNA 应该去除干净，RNA无降解；RIN值大于等于7
• 样品保存运输：RNA用离心管保存，封口膜封口后用干冰运输，组织样品则用冻存管保存，干冰或液氮运输 

实验流程

检测原理

      通过高通量测序技术检测circRNA最关键的原理是寻找反向剪接的reads，即back-splicing reads。

数据分析

分析结果

1. circRNA预测及数目统计

       应用Memczak等[1]的方法进行circRNA的预测。每个样本mapping到基因组各个染色体的reads以及back-splicing reads可以通过圈图展示。

图1. 基因组覆盖分布图。

以1K的窗口得出基因组的一个覆盖分布，图中最外圈为基因组，里面每一个圈表示一个样本的染色体reads覆盖，其中红色代表该样本中back-splicing reads的覆盖情况。

      对所有预测获得的circRNA与circBase数据库[2]的已知circRNA的位置信息进行比较，可以区分出新预测出来的novel circRNA和已知的known circRNA，统计如下：

2. circRNA表达定量及差异分析

      目前，对于绝大多数的circRNA而言都无法获得其完整的序列[3]，因此只能用circRNA的back-splicing位点处的junction reads来计算其表达量，这里我们采用SRPBM [4]对reads进行归一化处理。用edgeR [5]软件计算筛选差异表达的circRNA，得出p-value后进行多重假设检验校正，通过控制FDR（False Discovery Rate）来决定p-value的阈值，校正后的p-value即q-value。

3. circRNA关联基因的GO和KEGG富集分析

       根据circRNA的位置信息，可以获得与circRNA所在基因组位置上相关联的蛋白编码基因，然后我们对差异circRNA所对应的基因进行GO和KEGG富集分析。

图3. circRNA关联基因的GO富集散点图

4. circRNA-miRNA靶向预测及网络构建

      用miRanda软件[6]预测差异表达circRNA与miRNA的靶向结合关系，并绘制网络图。

参考文献
[1] Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, Torti F, Krueger J, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 2013, 495(7441):333-338.
[2] http://circrna.org/
[3] You X, Vlatkovic I, Babic A, Will T, Epstein I, et al. Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulated by development and plasticity. Nat Neurosci 2015,18(4):603-610.
[4] Li Y, Zheng Q, Bao C, Li S, Guo W, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res 2015, 25(8):981-984.
[5] Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 2010, 26(1):139-140.
[6] Enright AJ, John B, Gaul U, Tuschl T, Sander C, et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biol 2003, 5(1):R1.