继ZFN(Zinc Finger Nucleases)技术后,Merck在2013年推出新一代基因组编辑工具--CRISPR/Cas9,让研究人员以更快、更经济的方式实现基因组特定位点的编辑。凭借过去10年在基因组编辑领域的丰富经验积累以及专业的生物信息学平台,Sigma已经成功设计出覆盖人类,小鼠和大鼠三个物种的所有基因的CRISPR/Cas9载体,并可以提供在线定制服务。新推出的小鼠和人全基因组文库更是广大科研工作者的福音。

CRISPR/CAS系统简介
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是成簇的、规律间隔的短回文重复序列,是生物体为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。其中II型CRISPR/Cas免疫系统的发现,使RNA介导的基因组编辑技术成为简单、方便、快速的功能基因组学研究工具。

CRISPR/CAS工作原理
CRISPR最早在细菌和古细菌中被发现,很可能是是生物体为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。入侵病毒的短DNA序列(spacers)插入的细菌基因组的CRISPR基因位点,从而充当初次感染的“记忆子”。再次感染会激发补充成熟CRISPR RNA(crRNA)寻找匹配的序列,在特异的外源DNA序列处形成双链断裂。

CAS9核酸酶及必要组件
CAS9是一种核酸酶,可通过crRNA和tracrRNA(或反式激活crRNA)的介导实现特异DNA序列的剪切(Deltcheva, et al. 2011)。介导RNA(gRNA)的设计可包含模拟tracrRNA-crRNA复合体的发卡结构(Jinek, et al. 2013),而CA9的特异性结合基于gRNA和PAM序列(三个核苷酸NGG序列,也称为protospacer adjacent motif sequence)(Mar-raffini and Sontheimer, 2010)。因此,作为位点特异性的基因组编辑工具,CRISPR/Cas9系统至少需要Cas9核酸酶和gRNA。

CRISPR/Cas9系统的优势
首先,该系统非常简单,因为它只需要Cas核酸酶和可识别目标序列的gRNA即可实现位点特异性的剪切。其次,即使该系统来源于细菌,但数据表明其在哺乳细胞内具有高水平的剪切活性(Conget al.,2013, Mali et al.,2013),尤其同时针对多个目标时(Wang et al.,2013)。第三,需要NGG序列使无脱靶效应的基因组区域的目标设计更简单直接。最后,CRISPR是一种快速、经济的基因组编辑工具,可用于修饰多种生物的基因组。

多样化的CRISPR产品线
即用型的单载体Cas9和gRNA表达质粒
密码子优化的Cas9蛋白与gRNA同时表达,可方便制备即用型的转染级DNA。
单质粒表达系统,只需转染一个质粒,大大降低转染难度,最大限度地增加转染效率。
独有的CRISPR位点设计最大限度降低脱靶效率,适用于人、小鼠、大鼠等多个物种,并提供个性化定制。
通过2A肽策略使GFP或RFP与Cas9共表达,可追踪转染效率和通过FAC筛选富集阳性细胞,大大简化流程。


Cas9-D10A双切口酶系统
经过改造的Cas9-D10A双切口酶系统,配合使用一对gRNA,分别在相对的两条DNA链上产生切口,从而形成功能性的双链断裂。这种设计能最大限度降低脱靶效应。预设计的CRISPR双切口酶系统适用于人、大鼠、小鼠基因组,针对其他区域和物种的设计可进行个性化定制。
 


高度纯化的RNA系统
纯化的gRNA和Cas9 mRNA直接用于胚胎显微注射,可避免启动子不兼容性和质粒随机整合的风险,尤其适用于胚胎注射以及对dsDNA敏感、存在启动子细胞不兼容的细胞。因此,CRISPR RNA形式是构建转基因动物模型和在乎基因组质粒整合风险的科研人员的理想选择。
 

CRISPR Sanger全基因组文库
Sigma与Sanger Institute (Cambridge, UK)合作开发了人/小鼠全基因组CRISPR文库,并拥有其独家经销权。该CRISPR文库含有380000个克隆,涵盖了16000个蛋白编码基因。此外,我们还可以提供Mission shRNA文库,以及shRNA和CRISPR的文库组合,尽力满足客户更多的需要。



CRISPR阳性和阴性对照
经过检测盒验证的人EMX1基因阳性对照,分为单gRNA系统(CRISPR-1-1SET)和双切口系统(CRISPR02-1SET),为科研人员检测基因组编辑效率提供了完美的对照。CRISPR通用阴性对照是单载体CRISPR表达载体,表达野生型Cas9核酸酶和不识别人、小鼠或大鼠已知基因的gRNA。

CEL I image of CRISPR01 positive control (lane labeled EMX1s4+Cas9) and CRISPR02 positive control (lane labeled EMX1s4, EMX1as4+D10A)
 


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