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Arraystar LncRNA芯片
人类 V4.0版本; 小鼠 V3.0版本

LncRNA高通量筛选利器，同时检测lncRNA和mRNA的表达量变化

优势

检测lncRNA表达量灵敏度高、技术最成熟。lncRNA表达水平比mRNA低，芯片比RNA-seq更适合对低丰度RNA分子的检测。
收录lncRNA更新最及时，覆盖最全面、最可靠。可同时检测lncRNA和编码蛋白的mRNA。
注释LncRNA基因组信息、分类及潜在的调控机制，为深入研究lncRNA复杂生物学功能提供参考信息。
设计针对lncRNA不同转录本异构体的转录本特异性探针，对不同转录本检测更准确、特异性更高。
提供丰富的数据信息，用于调控型lncRNA与编码蛋白的mRNA之间共表达及关联研究。

介绍

       DNA转录形成的RNA中绝大部分是长链非编码RNA（lncRNAs），lncRNA与mRNA分子结构相似，但没有蛋白编码能力。这些lncRNAs有的从基因组中蛋白编码基因附近位置转录形成，有的位于基因间区，即lincRNA。（图1, 顶部）. LncRNAs能够在多个层面（转录及转录后层面）调控基因的表达水平，参与了基因组印记、染色质表观修饰、转录激活、转录抑制等多种重要调控过程（图1, 底部）。越来越多的LncRNAs在疾病和生物学过程中发挥重要功能。一些悬而未决的谜团，例如染色体沉默、生长发育及分化过程、肿瘤的发生发展，已经被lncRNAs揭开。与mRNA相比，lncRNAs具有更好的组织特异性，是进行分子标志物研究的理想分子。目前基因表达谱检测技术不仅可以检测传统的蛋白编码mRNA，也可以同时检测非编码RNA分子。

图 1. 根据LncRNA和蛋白编码基因的不同位置关系进行分类 （顶部）。LncRNAs可以通过不同机制调控基因表达，例如招募染色质重构复合体，在表观层面调控基因表达；作为增强子促进mRNA表达；影响核内亚结构 ；影响核质转运过程；通过miRNAs介导的ceRNA机制发挥作用； 影响mRNA的稳定性及翻译；通过顺式或反式调控的方式，在转录或转录后水平发挥调控作用 （底部）。

       Arraystar是lncRNA芯片技术的领跑者，创新性的将lncRNAs与mRNAs设计在同一张芯片上进行检测。迄今为止，利用Arraystar lncRNA芯片已经发表了大量高水平文章，成为研究lncRNA强有力的工具。 目前Arraystar通过迅速整合学科前沿和数据库中的新lncRNA，发布了最新版本的人类V4.0 和小鼠V3.0 LncRNA表达谱芯片。

最全面的检测范围：金标准LncRNAs, 可靠的LncRNAs以及编码蛋白的mRNAs

       与具有详尽注释的蛋白编码基因不同， lncRNAs常常缺乏注释，信息分散且收集不全。Arraystar拥有高质量的转录组和lncRNA数据库，通过生物信息学方法建立了科学、严谨的lncRNA筛选流程。 Arraystar人类LncRNA V4.0芯片共收录了40,173 个lncRNAs，主要分为两大类：7,506个金标准LncRNAs和32,667个可靠的LncRNAs，实现了对所有权威数据库（如Refseq, USCS Known Genes, GENCODE, lincRNA catalogs, lncRNAdb, T-UCRs, RNAdb, NRED 等）、高水平文章和超过47 Tb RNA-seq数据中的lncRNA最全面、最可靠和最及时的整理和收集。

金标准lncRNAs
       金标准lncRNAs全部采用经过详细注释和实验验证确定的lncRNAs，剔除了公共数据库中大量的lncRNA部分片段、不完整的UTRs和不可靠的lncRNAs。金标准lncRNAs具有完善的信息标注，包括转录单位、转录本异构体、功能机制以及亚细胞定位。它们的主要来源如下：

  • lncRNAdb v2.0汇集了功能性 lncRNAs [29]；
  • Arraystar 筛选和收集了高水平文章中的lncRNA；
  • Level 1 GENCODE v21 精心挑选了具有RT-PCR-seq方面实验数据支持的LncRNAs [34]；
  • Refseq 严格筛选了可信度高、具有全长序列的LncRNAs ；
  • Arraystar 通过ENCODE CAGE Clusters,，PolyA-seq，深度RNA-Seq以及capture seq获得的，具有5’TSS、3’末端和表达量信息的全部lncRNA转录本 [27, 28]。
可靠的lncRNAs
       除了金标准lncRNA外，其他的 lncRNA序列主要通过整合数据库和经典文献中的转录单位（Transcription Units）而获得。DNA链的转录起始于DNA模板的一个特殊起点，并在一个终点处终止，此转录区域称为转录单位。根据转录本长度、来源数据库和其他有效信息，每个转录单位挑选一个最具代表性的lncRNA进行检测。最终从308,525个lncRNA序列中筛选出32,667个可靠的 LncRNAs分子。

编码蛋白的mRNAs
       根据与UniProt蛋白数据库的匹配程度，将RefSeq 及GENCODE数据库中收录并筛选的蛋白编码mRNA分为3类，依次为权威的、非权威的和不匹配的。Arraystar的人类V4 LncRNA芯片共挑选并收录了 20,730个编码蛋白的转录本。

LncRNAs的详细注释和功能分析

       一站式芯片技术服务包含系统而详细的lncRNA注释、子类分析等重要分析项目，这些信息有助于揭示lncRNAs复杂的生物学功能。通过研究发现，lncRNAs在凋亡、分化、发育等多种生物学过程以及人类疾病，如癌症、神经系统疾病及心血管疾病中发挥重要功能。针对上述研究报道的所有LncRNAs，我们提供了全面的注释便于交叉引用，帮助您深入了解lncRNAs的生物功能和分子机制。

基因组结构
      根据LncRNAs在基因组上相对于蛋白编码基因的位置关系，可以系统的将其分为 （1） Intergenic （LincRNA），（2） Intronic，（3） Bidirectional，（4） Sense-overlapping，（5） Antisense ，（6） Pseudogene这6种类型 （图 1），这种位置关系对于推测lncRNA的功能具有很大帮助，包括调控方式是顺式（cis）还是反式（trans），调控层面是转录还是转录后。

高度保守的LncRNAs
       基因组中高保守区域（UCR） 或高保守非编码元件（UCNEs） 转录出来的lncRNAs可能具有重要的生物学功能。在其他物种中与人类基因组结构相同的lncRNAs（即使只有中度同源）也会被收录。因为与全序列保守性相比，基因组结构与基因调控的关系更加密切[1]。

组织特异性lncRNAs
       LncRNAs呈现出严格的组织或时序特异性，可能与其发挥的功能密切相关[1]。其中特别标示出6,059个与细胞谱系或癌症相关的lncRNAs分子[28]。

疾病相关 lncRNAs
       包含了LncRNADisease数据库中收录的已知与疾病相关的lncRNAs [40]。

疾病SNP相关lncRNAs
       覆盖带有疾病易感位点的LncRNAs ，可能与疾病发生发展密切相关。

在生物学功能中LncRNAs和mRNA的共表达
       收录了与生物学过程或功能基因集相关的LncRNAs （例如，血管生成、缺氧、代谢、增殖、细胞周期、细胞黏附、DNA损伤修复） [28]。

癌症相关LncRNAs
        LncRNAs可以在不同类型癌症中发挥作用， 通过上千例癌症样本中lnRNA的大范围研究表明，其表达量发生了癌症特异性改变。 [36-37].

基因间超长链非编码RNAs (vlincRNA)
      长度从50 kb到1 Mb，作用涉及多种生物学过程，例如多能性、癌症、细胞凋亡、细胞周期以及细胞衰老 [27, 38-39].

其他类型
       例如，缺氧诱导型非编码高保守转录本（HINCUTs） [41]，压力诱导型长链非编码转录本 （LSINCTs） [42]。


转录本特异性探针

       与mRNA一样，LncRNAs是以转录本的形式发挥功能的。特定基因位点往往可以转录出多个没有开放阅读框，不同功能的转录本。大部分芯片平台只针对基因的3’端设计“基因特异性”探针，无法有效区分不同转录本。而Arraystar LncRNA芯片针对剪切连接位点或外显子序列设计了“转录本特异性”探针，能够实现对不同转录本的准确、特异性检测（图 2） 。

 图2. BCL2L1基因的不同转录本BCL-XL、 BCL-XS和ENST412972在癌症中发挥着不同甚至截然相反的生物学功能。Arraystar LncRNA芯片设计的转录本特异性探针（红色）可以准确、特异性地区分不同转录本。 与之相比，基因特异性探针（紫/黄/绿色）无法区分不同转录本。箭头代表转录方向。

Arraystar LncRNA 芯片规格

人类V4.0
小鼠V3.0
探针总数
60,903
60,804
探针结合位点 转录本的外显子或剪接位点处设计特异性探针
探针特异性 转录本特异性
标记方法 标记cRNAs的全长，没有3’序列偏好性；即使对低丰度或部分降解的RNA转录本也可进行灵敏、高效的标记
检测LncRNAs数目
40,173
35,923
金标准LncRNAs
7,506
可靠的 LncRNAs
32,667
具有开放阅读框的LncRNAs
1,428
转录的假基因
699
3,419
蛋白编码mRNAs
20,730
24,881
LncRNA 来源 数据库（更新至 2015）:
Refseq, UCSC, GENCODE, LncRNAdb, RNAdb, NRED, lincRNA catalogs （Cabili et al 2011, Clark et al 2015, Iyer et al 2015）, ENCODE CAGE Clusters, PolyA-seq, deep RNA-Seq 及capture seq 数据库。 Arraystar 收集并筛选的LncRNA
引用文献:
2015年以前的科学出版物.		 数据库:
Refseq （05/2013）, UCSC Known Gene 6.0, Ensembl 38.71, Fantom3, RNAdb 2.0, and NRED;
引用文献:
lincRNAs [7,18,22,23], T-UCRs [11], Evolutionary constrained LncRNAs [24], Evolutionary Conserved LncRNAs [25].
mRNA来源 Refseq, GENCODE关联 UniProt 数据库 共识编码序列（CCDS） 数据库

比RNA-seq更适合于LncRNA表达谱检测

       利用RNA-seq进行lncRNA表达谱检测的一个主要问题在于绝大部分测序reads被表达丰度很高的RNA，如管家基因所占据。由于reads分布的这一统计学特征，使得RNA-seq对于低丰度RNA的定量不可靠 （图 3）。LncRNA的平均表达水平约为mRNA的1/10[1,5-6] （图 4），只有不到10%的lncRNAs能够被可靠的定量 （图 3）。

图3. 定量可靠的转录本比例与RNA-seq测序深度的关系。小圆圈代表30M的RNA测序深度下mRNA （红色） 和 lncRNA （蓝色）可靠定量的比率。只有不到 10% 的lncRNAs能够被可靠的定量 [2]。

   
图4. 在人体不同组织及细胞类型中检测到的lncRNAs平均表达水平约为蛋白编码 mRNAs的1/10。



芯片
RNA-测序
序列特异性的芯片探针可以高效识别lncRNA而不受其他高丰度RNA干扰。 低丰度LncRNA的测序深度会被高丰度RNA降低，导致90%以上lncRNA检测结果不可靠、不准确（图 4）。
对于低丰度RNAs，如lncRNAs，有更好的敏感度和准确性[4]。芯片通常可以检测到7000~12000个lncRNAs。 对于低丰度RNAs，灵敏度很低，增加测序量也不能提高检测准确度[3]。多达120M的reads只能检测到1000~4000个lncRNAs。
对于一类重要的lncRNA分子，即Antisense lncRNA实现了链特异性检测。 链特异性方向需要在测序文库构建的准备步骤确定。
Arraystar LncRNA数据库提供丰富、高质量的lncRNA信息。可以进行转录本特异性检测和定量。 LncRNA数据匹配过程往往存在差异。利用从头测序得到的lncRNA组装精度很低。
技术成熟完善。 技术手段不成熟，方法仍在不断发展[26] 。

差异表达基因的qPCR验证

       芯片筛选得到的差异表达基因需要经过qPCR验证才能进行后续研究。当挑选指标进行验证时，差异变化倍数 （fold change, FC），统计学显著性（p-values）以及初始信号值都会对结果产生影响。 FDR值 用来评估和控制假阳性出现的次数。

       qPCR验证的一般指导原则包括Tm值、GC含量、是否形成引物二聚体、引物特异性等。除了上述原则外，lncRNA的qPCR验证还需要考虑以下因素：更建议选用数据库（source）中经过充分验证确定的lncRNA序列；位置关系（relationship）为Antisense类型的lncRNA 需要设计链特异性RT引物进行cDNA合成 （图1, 顶部）；位置关系（relationship）为sense-overlapping 类型的lncRNAs引物设计在与mRNA的非重叠区域（图1, 顶端）；引物位置尽可能靠近探针 ； qPCR扩增产物需横跨剪接位点以保证转录本特异性扩增。理论上应该使用与芯片检测相同的RNA样本进行qPCR验证。

LncRNA高级数据分析

       深入的数据挖掘和高级分析项目（如图5、图6所示）， 帮助您充分利用芯片所提供的海量信息。

 图 5.CNC分析，在HCC中lncRNA与mRNA的部分共表达网络，选择与最多癌症相关mRNA具有共表达关系的lncRNA-HEIH作为研究对象

图 6. Lnc-GSEA 分析，用来确定重要生物学功能显著相关的lncRNA分子

LncRNA技术路线图

 图 7. 目标LncRNA后续研究的技术路线图，包括分子调控机制、生物学功能和分子标志物三大主要研究方向

引用 Arraystar LncRNA 芯片所发表的论文
（从近5年内约160 篇文献中摘录如下）

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       康成生物国内独家提供Arraystar LncRNA芯片全程优质技术服务；目前康成客户LncRNA芯片研究文章已达160余篇，其中多篇发表在国际顶尖杂志Cancer Cell, Molecular Cell, Hepatology等上。


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