DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction)

技术原理：简并寡核苷酸引物PCR，引物的3' 含6bp的随机序列，可以随机的和基因组DNA结合，从而实现对全基因组的扩增^[1]。

应用范围：因为PCR的指数扩增特性，放大了基因组上不同序列之间的差异，因而导致扩增出的基因组覆盖度较低。尽管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR适合对染色体的CNV进行定量。

商品化试剂盒：Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit。

图1 DOP-PCR技术原理[4]

MDA (Multiple Displacement Amplification)

技术原理：2001年由Laskin团队发明，使用随机的六聚体引物和φ29DNA聚合酶进行反应，该聚合酶具有很强的链置换特性，能够在等温的条件下，扩增产生50~100kb的DNA片段。同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的复制保真性^[2]。

应用范围：MDA法比DOP-PCR拥有更高的基因组覆盖度，φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性，使得MDA法在对SNV的分析，以及构建大片段文库上有着显著优势。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指数扩增，因此依然存在PCR反应的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，这种偏好性并不能重复，因此MDA法不适合进行CNV的分析。

商品化试剂盒：Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。 

图2 MDA技术原理^[4]

MALBAC (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles)

技术原理：2012年由谢晓亮团队发明，拟线性的扩增过程降低了指数扩增的序列偏好性。扩增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的随机序列，可以和模板在15~20℃的低温下结合，经过8~12个循环的拟线性扩增后，再对这些环状的扩增子进行指数扩增^[3]。

应用范围：MALBAC法的优势在于，虽然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的这种偏好性在不同的细胞之间是可重复的，因此可以通过对参考细胞标准化后，进行CNV的分析；另外，由于其扩增的均一性，MALBAC法扩增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱点在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在检测SNV时将会出现更多的假阳性；另外，由于它可重复性的序列偏好性，基因组上低扩增的区域有时会在扩增过程中丢失。

商品化试剂盒：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit; Rubicon, PicoPLEX WGA Kit。

图3 MALBAC技术原理[4]

由上述的分析可见，MDA和MALBAC各有优劣，实际上在不同的文献中，研究者也会根据研究目的的不同，采取不同的方式对基因组进行扩增，以满足研究的需要^[5-7]。

现在，安诺基因同时建立了MDA及MALBAC两种扩增平台，并在此基础上做了不断的技术改进，现已实现将基因组覆盖度提升至85~90%，高于文献水平。

表1 单细胞基因组覆盖度测试(实测80G数据量)

2016年3月，科技部发布精准医学研究计划，其中，临床用单细胞组学技术研发专项尤为瞩目。为助力精准医学研究计划，我们同时对单细胞全基因组重测序的信息分析内容进行了升级，新增了主成分分析、进化树分析、驱动基因分析、亚克隆结构分析等丰富的高级分析内容，深入推进单细胞测序技术在癌症检测、肿瘤干细胞、肿瘤目标区域等研究领域的应用。

图4 单细胞基因组信息分析内容

[1] Telenius H, Carter NP, Bebb CE, et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer[J]. Genomics, 1992,13(3): 718-725.
[2] Dean FB, Nelson JR, Giesler TL, et al. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification[J]. Genome Research, 2001, 11(6): 1095-1099.
[3] Zong C, Lu S, Chapman AR, et al. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell[J]. Science, 2012, 338(6114): 1622-1626.
[4] Lei H, Fei M, Chapman A, et al. Single-cell whole-genome amplification and sequencing: methodology and applications[J]. Annual Review of Genomics & Human Genetics, 2015, 16(1).
[5] Wang Y, Waters J, Leung ML, et al. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing[J]. Nature, 2014, 512(7513): 155-160.
[6] Ni X, Zhuo M, Su Z, et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients[J]. PNAS, 2013, 110(52): 21083-21088.
[7] Gawad C, Koh W, Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the scienc.[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.