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| 简介 迎接食品全球分销的挑战 在全球化的食品市场，随着食品研究和监控的需求不断增长，我们需要简化的检测方案，它们必须灵敏、准确、易用，且适合多种起始材料。Real-time PCR（聚合酶链式反应）作为食品检测部门常用的微生物培养方法和ELISA 分析的一种补充工具，正变得越来越重要。与专门的样本制备试剂盒结合，real-time PCR 分析为多种样本材料带来了快速的结果，并简化了检测过程。 |
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食品检测的现代方法 分子检测具有以下明显优势： ■ Real-time PCR 在大约3 小时内获得结果 ■ Real-time PCR 准确检测具有挑战性的病原体菌株 ■ 操作步骤很简单，且样本量大时可自动化 ■ Real-time PCR 是高度特异的，不受食品加工的影响 一个能满足您要求的综合检测系统 如今高质量的食品安全检测项目为检测分析以及样本制备方法提出了更高要求： 顶尖性能 分析对于待测目标必须是灵敏、特异的，且耐受检测抑制。这种性能取决于起始材料的质量，因此，样本制备方法必须是高效的。 易于使用 样本制备方法和检测分析必须简化、可靠且操作步骤对用户友好，它们能轻松改变，适合多种应用。 速度 样本制备所耗的劳力必须最少，如果可能，应自动化以便处理大的样本量。检测分析必须带来快速的结果，并适应高通量。 多样性 样本制备方法必须兼容多个样本类型，同时以简化的步骤带来高效的结果。此外，检测分析必须覆盖多种已知的食品污染物或病原体。 标准化 样本制备和检测分析都必须整合成一个连贯的流程，实现样本处理的标准化。 |
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| 简化食品安全检测的关键特征 mericon™ 食品检测产品线是一整套分析试剂盒，它们能满足上述要求。基于real-time PCR 的检测，mericon PCR Assays 和样本制备试剂盒实现了对食品、动物饲料或药品中多种病原体、转基因生物、过敏原及动植物成分的快速、可靠检测。QIAGEN 产品的主要优势在于和谐的检测步骤，流程仅仅在样本制备方法上不同（图1）。QIAGEN 提供专为处理多种食品材料而设计的新样本制备方案，提高整体流程性能。这些样本制备试剂盒从微生物扩增培养物或直接从各种食品基质中高效提取DNA，并且降低复杂食品样本中固有的PCR 抑制剂残留。 通用、简化和快速的样本制备 我们的样本制备试剂盒能够从多种样本类型中提取DNA，包括微生物扩增培养物或原始或经加工的食品材料。特别值得一提的是DNeasy® mericon Food Kit 是改良CTAB 提取法。非离子去污剂CTAB 广泛用于从多种组织类型中高效提取总的胞内核酸。CTAB 可高效释放并与DNA结合或去除胞内抑制剂。但与耗费劳力的传统CTAB 提取步骤相比，DNeasy mericon Food Kit 的步骤明显加快，能在2.5 小时内处理最多30 个样品，且从根本上减少流程步骤数（图2）。提取出的DNA 与传统CTAB 法提取出的在质量和纯度上相当。 |
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| 快速灵敏的检测 | |
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在生产过程中，食品受到热、辐射、高压及pH 变化的影响，这些会导致DNA 降解和片段化。我们开发出DNeasy mericon Food Kit 的优化试剂，以便回收短的DNA 片段（低至100 bp），确保即使高度片段化的DNA 也能有效分离，并随后在PCR 中扩增。正因为这些特征，DNeasy mericon Food Kit 成为一种普遍适用的提取方法，即使是处理高度加 工、脂类、酸性、高或低DNA 含量的食品样品，也能产生可靠的结果（图3 和4），再也无需针对不同食品基质使用多种裂解方法。 快速获得结果，灵活的通量 食品样本的检测，从样本制备和反应体系构建，到real-time PCR 的检测，大约需要3个小时。而且，简便的操作步骤适用于应用特异性的通量需求，或不同实验室特定的通量需求，即使是覆盖多个目标和样本类型的高通量食品安全检测项目也可高效完成。 高度灵敏且特异的目标检测 Real-time PCR 是一种非常灵敏且高特异性的检测方法。为了进一步提高mericon PCR Assays 的灵敏度和特异性，试剂盒包含了Multiplex PCR Master Mix，它特有高效的HotStarTaq Plus Polymerase，专利的多重PCR 技术（如Factor MP）和快速循环技术（包括Q-bond®）。这些特征形成了灵敏、特异、高效的反应环境，且高度耐受食品样本基质中含有的PCR 抑制剂（图4）。一般而言，每个mericon PCR Assay 可检测低至10 个目标拷贝。每个试剂盒的特异性经过相关物种大量非目标DNA的交叉检测。 图3. 高产量DNA 和极低的抑制剂残留。使用DNeasy mericon Food Kit 及来自其他3 家供应商的试剂盒，以标准实验方案处理花生酱和巧克力（困难且高度抑制性的食品基质），以扩增叶绿体trnL tRNA 基因。A 与其他试剂盒相比，DNeasy mericon Food Kit 所制备样本的阈值循环数（CT）较低。B 用纯化后DNA 进行操作，当样本以1:10 稀释时，此分析产生了2.9–3.5 的CT 变化。较低的变化则说明PCR 抑制剂的存在。样本以1:10 稀释，且扩增相同的DNA 片段。DNeasy mericon Food Kit 制备的洗脱液不含抑制剂，如图中所示CT 变化大约为3。其他试剂盒制备的洗脱液则表现出程度较大的抑制剂污染。所有数据都以固定的样本量标准化，以避免试剂盒起始量、稀释步骤和洗脱体积的差异。 * DNA 扩增一次重复。 |
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| 病原体 | |
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| 食品中微生物污染的灵敏检测 到目前为止，检测食品中是否存在病原体的主要方法是通过培养物制备和/ 或ELISA 分析。分子方法，特别是real-time PCR，为这些经典方法提供了内容丰富的补充。此外，real-time PCR 检测在更短时间内带来结果（图5），提供了更高的灵敏度和特异性，以及处理困难食品基质的可靠性（图6）。总之，real-time PCR 是一种检测困难病原体菌株的安全方法。图5. 不同病原体检测方法的时间比较。real-time PCR 分析不仅带来了灵敏且高特异性的结果，而且比传统的病原体检测方法更快。免疫分析和传统的培养方法所需时间长，不够灵敏，也耗费更多人力。 |
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| Real-time PCR：一个高特异性的精密工具 鉴于某一特定微生物污染物的致病性可能随种类甚至菌株而异，有时必须可靠地检测单个病原体种类或菌株。因为real-time PCR 检测是基于非常特异的DNA 序列扩增，所以mericon PCR Assays 有着准确区分所需的特异性水平，例如区分高度致病性的单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）及其他常见的李斯特菌（Listeria），或特异检测分泌志贺氏毒素的大肠杆菌（Escherichia coli）。 轻松可靠的样本制备 为了让病原体扩增培养物的微生物样本制备有一种简化直观的方法，QIAGEN 已经设计出基于机械裂解（利用磁珠）和热裂解（通过煮沸）的操作步骤，它们为不同的细菌类型带来了更佳的裂解效力。热裂解是为大多数容易裂解的革兰氏阴性菌（如沙门氏菌属Salmonella spp.、弯曲杆菌属Campylobacter spp.，和阪崎肠杆菌属Cronobacter spp.）而优化的，而机械样本制备的先进特征则为较困难裂解的革兰氏阳性菌（如李斯特菌属Listeria spp.）提供所需的裂解条件（图 7）。两个样本制备系统都带来了适合real-time PCR 分析的DNA 悬液，特别有利于mericon PCR Assays 探针法试剂。mericon DNA Bacteria Kit 和mericon DNA Bacteria Plus Kit 中包含的精心配制试剂提高裂解效率，稳定了提取出的DNA，且去除了可能干扰下游应用的抑制剂。 有了这些专门的样本制备试剂盒的方法，即使从少量样本中提取出的DNA 也适合灵敏的realtime PCR。方法的灵活性（使用机械或热裂解）适应多种微生物。 |
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图7. 从革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中高效提取DNA。nA 将单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）的扩增培养样本稀释，并按照mericon DNA Bacteria Plus Kit 的机械（微珠）裂解试验方案或mericon DNA Bacteria Kit 的热（煮沸）裂解试验方案进行操作，以评估裂解效率。对于这种革兰氏阳性菌，机械裂解使提取效率更高，这在细菌浓度极低（最高稀释）时最为明显，机械裂解的平均循环阈值数要低4.9。nB 在一个相似的实验中，将牛奶和榛子酱中的肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）扩增培养物的稀释和未稀释样本按照机械和热裂解试验方案进行处理。总的来说，两种制备方法对于革兰氏阴性菌的DNA 提取效率相当。 |
| 转基因生物 | |
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| 转基因生物的可靠鉴定 | ||
表1. mericon Screen Nos Kit 和mericon
Screen 35S Kit 的交叉反应实验结果 +：检测结果为阳性。 –：无检测信号。 |
确定食品中转基因生物（GMO）的存在需要检测转基因和同源转基因生物的遗传物质。Real-time PCR 技术特异检测目标DNA 序列，是检测食品中来源于GMO 物质存在的首选方法。mericon PCR 试剂盒含有特有靶定常用遗传物质的引物和探针，如nos 终止子和35S 启动子。因此，这些检测为广泛使用GMO 的存在带来了决定性的检测信号（表1）。对于某一特定GMO 的鉴定，mericon 食品检测产品线包含了一套检测，能靶定多种GMO 中每个独特的DNA 序列，如Roundup Ready 抗农达大豆、Bt11 玉米或MON810 玉米。这些试剂盒的检测是高度灵敏且特异的。 | |
| 一个高效的样本制备方案，适合所有起始材料 转基因生物检测所使用的样本常常是原始植物材料、种子和加工过的食品，这些是富有挑战性的起始材料，含有困难的食品基质。足量且高质量的DNA 提取对于GMO 的可靠检测是必需的，并且对任何检测系统的灵敏度很关键。DNeasy mericon Food Kit 满足了这种需求，能够利用一种简化、通用的CTAB 法DNA 制备步骤从多种混杂的起始材料中高效提取DNA（第3 页）。流程步骤比传统CTAB 法更少，故可在2.5 小时内处理最多30 个样本。这些试剂盒的DNA 回收很高，低至100 bp 的DNA 片段（图8）。DNeasy mericon Food Kit 纯化试剂盒配合mericon PCR Assays 的检测，为检测GMO 创建了一个简化的流程，带来了高效的样本处理和可靠的结果。 |
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| 图8. 使用优化实验方案的DNA 片段回收率提高。使用DNeasy mericon Food Kit 的标准实验方案和小片段实验方案对玉米片和番茄酱的样本进行处理，这些精加工的食品含有高度片段化的DNA 和可可粉（一种富含抑制剂的食品基质）。为了检测这些实验方案的回收效率，在离心柱纯化之前将样本加标人100 bp DNA 片段。洗脱液中的人DNA 片段是利用片段特异的探针型PCR 系统扩增的。小片段实验方案的结合条件明显提高了所有三个样本的回收效率，使循环阈值数（红色、绿色和粉色曲线）比传统步骤（蓝色曲线）低了最多3.1 个。这大致相当于小片段的回收效率增加至原来的10倍。 |
| 过敏原 | |
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| 消除过敏原检测的交叉反应性 | |
表2. 核桃DNA 的特异性分析 +：检测结果为阳性。 –：无检测信号。 |
ELISA 方法在过敏原检测中很流行，尽管其会导致交叉反应性（如杏仁和花生之间的过敏原交叉反应性）。PCR 方法正在此领域中占据一席之地，因为过敏原特异的DNA 序列的直接检测赋予了其杰出的特异性。这种高特异性几乎可完全消除关于检测交叉反应性的顾虑（表2）。此外，real-time PCR 检测过敏原DNA 的灵敏度和特异性与过敏原DNA 和食品DNA 的比例无关。而这种比例常常会给ELISA 带来问题，因为过敏原通常以痕量存在，因此，特定过敏原的免疫信号可能被食品材料中的交叉反应分子所覆盖。mericon PCR Assays 能检测每个反应中低至10个拷贝的过敏原DNA。因此，real-time PCR 能高度特异地检测引起过敏的食物组分。 证据支持的过敏原DNA 检测的有效性 引起过敏反应的物质从根本上说是一个蛋白。这就提出了一个问题，将过敏原检测建立在筛选DNA 的分子方法上是否适当，特别是在以过敏原定量为目标时。目前有充分的证据证明直接检测过敏原蛋白的过敏原定量与过敏原DNA 的检测之间存在关联(1)。 |
| 此外，过敏原DNA 的检测还具有更多优势： ■ 过敏原DNA 的检测比蛋白检测更加可靠，因为食品中并非所有的过敏原蛋白都是已知的，因此也就没有包括在ELISA 分析板上。 ■ DNA 提取是高度标准化的，产生了纯的DNA，而蛋白提取通常并不是目标或食品基质特异的。 ■ DNA 即使在高度加工的食品中也能检测，而蛋白很容易降解，或与食品基质中的组分发生反应，从而变得难以检测。 ■ 与ELISA 不同，PCR能够区分亲缘关系相近的物种（如芹菜及其他伞形科植物，或木本坚果）。 ■ PCR分析包含了多个加工对照，能增强整体的过程安全性。 mericon PCR Assays 提供了高度标准化的过敏原检测方法，能实现不同食品类型、过敏原类型及检测实验室所得结果的真实比较。这种标准化的一个原因是试剂盒中所包含的PCR 引物和探针的结合特异性。第二个原因是这些分析耐受食品基质中所存在的抑制剂的作用。第三个原因是，与蛋白分析不同，DNA 检测对食品加工所引起的分子修饰不敏感。这与ELISA 检测结果的可变性相反，因为抗体设计的性质以及抗体结合对反应条件和蛋白构象的依赖性。与mericon PCR Assays 的高性能相结合的是DNeasy mericon Food Kit 所带来的高效DNA 提取。为处理多个食品类型而设计，这个样本制备试剂盒能实现高质量的DNA 提取，即使是高度加工的食品，其中的过敏原DNA 含量已很低（图9）。 |
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| 图9. 使用DNeasy mericon Food Kit 高效制备DNA。使用DNeasy mericon Food Kit 制备困难食品类型的样本，用于分析。玉米片和番茄酱是高度加工的食品，其DNA 严重片段化，并且番茄酱含醋，酸性较高。巧克力包含了几种强的PCR 抑制剂。通过叶绿体tRNA 基因trnL 的扩增，扩增曲线显示了植物DNA 的成功检测。每条曲线是样本制备的一次重复。以纯的DNA 开展，当样本以1:10 稀释时，此分析的循环阈值数（CT）有着2.9–3.5 的阳性变化。未稀释样本和稀释样本的阈值循环CT 变化落在此范围内，说明在DNA 制备中抑制剂的去除率很高。 |
| 成分真实性 | |
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| 对加工食品成分的可靠检测 加工食品、动物饲料及药品中成分的特征对食品安全性检测正变得日益重要。食品生产中所使用的材料来源于日益多样化及世界各地的供应商，因此，确定食品中所包含的动植物成分能确保统一的标准，解决了食品欺诈（在高端食品中使用低质量的材料）、文化因素（如犹太和清真食品），以及与食用未公开成分相关的健康风险。 |
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表3. 使用mericon Pig Kit 进行交叉反应的实验结果 +：检测结果阳性。 –：无检测信号。 |
过去，食品中动植物材料的评估是利用ELISA 分析和蛋白质图谱分析（双向脉冲场凝胶电泳，2D PFGE）来开展的。两种方法都是检测特定的植物或动物物种中特异蛋白的存在，因此对食品加工所引起的蛋白构象变化（变性）很敏感。蛋白结构的变化降低了抗体结合，并影响了凝胶中的分子迁移。因此，这些方法的结果并不一定可靠。此外，这两种方法都是劳动密集的，需要优化。相反，通过real-time PCR 检测来源于特定动物或植物的DNA 则不易受加工修饰的影响，因此是一种高度可靠且稳定的替代检测方法。mericon PCR Assays 的特异性可从表3 的交叉反应性结果中明显看出。在家猪和野猪中获得了阳性的检测信号，但其他检测动物未获得。 | |
| 处理富有挑战性起始材料的灵敏度 动植物材料常用于微量的食品添加剂。由于量少以及含有添加剂的食品的高度加工性质，检测动物或植物材料的存在往往很困难。另外，这些样本的可靠检测必须有一种提取方法，能够从困难的食品基质（如肉类样本）中提取出DNA，以及一种分析，其灵敏度能检测出极低水平的掺杂物（图10）。  图10. 对痕量猪DNA 的可靠检测。使用mericon Pig Kit 对DNA 含量由高至低的梯度稀释样本中的猪DNA 进行检测。大量的DNA 并不干扰PCR 反应，相反，分析十分灵敏，能检测低于10 个拷贝的靶DNA。 参考文献： 1. Pederson, M.H., et al. (2008) Soybean allergen detection methods — a comparison study. Mol. Nutr. Food Res. 52, 1486. |
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