相对sequel试剂升级带来的数据量增加，其带来的转录本数目增加几乎可以忽略不计。

虽然sequel试剂在不断升级，每个SMART Cell上的数据产出在不断提升。然而，该数据产量增加主要是通过读长增加做到的。也就是说，测的越来越长（如表1所示，从2.0芯片到3.0 LR芯片，测序长度提升了5倍），得到的数据量越来越高了（从2.0芯片到3.0 LR芯片，数据量提升了8倍），转录本数量却未必增加了多少！

表1. Sequel平台不同版本试剂数据表现

目前的测序长度几乎可以覆盖所有的转录本长度，继续增加读长，得到更长转录本的概率极低。

也许有人会说，测得长也挺好啊，我需要的就是全长转录本啊。那么，是不是测得越长得到的全长转录本数目越多呢？事实上，绝大部分的转录本长度都在2Kb以下，在sequel 2.1芯片测序平均读长23K的情况下，就可以覆盖到几乎所有的转录本；sequel3.1 LR芯片测序读长可达80K，得到更长转录本概率极低。如何让多出来的读长发挥更大的价值，可能是我们需要考虑的问题。

测序长度越长，序列准确度越高，但增加测序长度不是提高序列准确度的唯一方法，且该方法性价比不高。

Sequel测序中构建哑铃型文库，在插入片段比酶读长短的情况下，通过环形比对测序（Circular Consensus Sequencing, CCS），同一个片段可以被循环测到很多次，这在很大程度增加最终得到的序列准确性。目前2.1试剂测序得到的CCS序列准确度在0.93左右，随着测序长度不断增加，CCS序列准确度会得到进一步提升。

图3 CCS测序示意图

在sequel数据分析中，为了提高最终得到的转录本序列的准确度，得到CCS序列之后会进行reads聚类和isoform校正，进一步提高isoform准确度，同一isoform测到的条数越多，校正后的准确度越高。这一步可以通过阈值设定，筛选准确度达到要求的用于后续分析，目前一般将isoform校正后准确度在0.99以上判定为高质量isoform。

所以，随着sequel测序读长的增加，得到isoform准确度会增加；同时我们还可以通过isoform校正来提高isoform准确度，同一isoform测到的条数越多，校正后的准确度越高。相对来说，提高测序reads数既能提高isoform准确度又能增加基因/isoform检出量，性价比更高。

图4 Isoform校正过程示意图

综上所述，目前sequel试剂升级带来了数据产量和测序读长的大幅提升，但并不能提高最终检测到的转录本数目和长度，在提高测序准确度方面性价比也不高，很大程度上浪费的sequel的数据量和读长。

那么如何让sequel试剂升级发挥更大的价值呢？

为什么不试试5X全长转录组？！

为了充分利用sequel测序越来越多的数据，华大基因Dr.Tom主导研发5X全长转录组产品，在建库过程中将多个转录本首尾相连构建sequel文库；通过CCS测序，一条CCS read可得到多条转录本，大幅提升sequel测序全长reads的获得率。

5X全长转录组产品将UMI（Unique molecular identifier，特异性分子标识符）和数据量提升完美结合，全长转录组也可以做基因定量了！如下图所示，5X全长转录组基因定量结果和短读长测序（PE测序）定量结果一致性好，后者是目前普遍认可的基因定量方法。而常规全长转录组测序和PE测序的一致性极差，完全不能用来定量。