技术优势

研究内容

        利用BGISEQ平台，对富集到的18-30nt的小RNA片段进行测序，对获得的有效数据进行序列长度分布统计，将筛选后的高质量序列分类注释，从而获得样品中包含的各组分及表达量信息，并对所有小RNA片段进行注释，对miRNA进行靶基因预测等分析。

一、标准分析

1、数据产出统计，对原始信息采集数据去接头污染，去低质量reads         

2、18-30 nt Small RNA 信息采集结果的长度分布         

3、Small RNA在选定的参考基因组上的分布(只能选定一个参考基因组)

4、Small RNA分类注释

①Small RNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息   

②Small RNA与重复序列的比对信息

③Small RNA与exon/intron的比对信息    

④Small RNA与miRBase中指定范围的已知的miRNA的比对

⑤miRNA家族分析

⑥动物保守piRNA注释分析(分析仅针对数据库中已有的物种：人、小鼠、斑马鱼、线虫、果蝇、大鼠、鸡、家蚕)

5、Small RNA预测(miRNA/siRNA/piRNA)

6、已知和新Small RNA 定量分析(miRNA/siRNA/piRNA)

7、已知和新Small RNA差异表达分析(miRNA/siRNA/piRNA)

8、已知和新miRNA表达/差异表达聚类分析

9、Small RNA 靶基因预测(miRNA/siRNA/piRNA)

10、差异Small RNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析

二、高级分析

1、差异miRNA与差异靶基因的相关性分析；

2、差异miRNA与差异靶基因互作网络绘制；

3、互作靶基因功能富集分析（KEGG和GO）；

三、定制化信息分析

可结合客户的材料与需求，协商确定定制化信息分析内容。

疾病miRNA表达谱——microRNA分析揭示IL1途径在风湿性心脏瓣膜病中潜在增强

Comprehensive microRNA profiling reveals potential augmentation of the IL1 pathway in rheumatic heart valve disease[J]. BMC cardiovascular disorders, 2018, 18(1): 53.

研究摘要

        心脏瓣膜病是心血管病死亡的主要原因，中国尤甚，超过一半的心脏瓣膜病是由急性风湿热引起，但心脏瓣膜病的miRNA谱未知。本次研究采用4例风湿性心脏病患者（2例中度，2例重度）和1例健康人对照的血清样本进行高通量测序，患者中共有的下调miRNA 91个，上调miRNA 13个。进行靶基因和功能预测后，选取9个miRNA利用qRT-PCR做大样本验证。在40例患者（20例中度，20例重度）和20例健康人中，发现2个miRNA（hsamiR-205-3p和hsa-miR-3909）分散度低，风湿性心脏病患者显著降低，先天性心脏病患者与健康人无明显改变。预测hsamiR-205-3p靶向IL-1β，hsa-miR-3909靶向IL1R1，并利用荧光素酶测定验证miRNA抑制靶基因表达。免疫组化测定靶基因编码蛋白的表达量，得出在风湿性心脏病患者中比在先天性心脏病患者中IL-1β、IL1R1 的表达量更高。

研究结果

图1  患者中共有的91个下调miRNA、13个上调miRNA靶基因功能分析。

图2  9个miRNA利用qRT-PCR进行大样本验证。

图3  IL-1β、IL1R1在风湿性心脏病患者中比在先天性心脏病患者中表达量更高。

miRNA机制研究——寄生昆虫衍生的miRNA调节宿主发育

Parasitic insect-derived miRNAs modulate host development[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2205.

研究摘要

        寄生蜂会产生毒液、多DNA病毒（PDV）、畸形细胞等，改变宿主的生理状态有益于后代存活，但改变的潜在分子机制仍不清楚。本研究发现寄生蜂（C. vestalis）的畸形细胞、多DNA病毒（嵌入到寄生蜂基因组中特有的共生病毒）CvBV可以产生miRNA并通过不同方式将其传递到宿主中。寄生宿主小菜蛾（P. xylostella）中某些miRNA主要由畸形细胞产生，而寄生宿主中由CvBV编码的miRNA的表达水平比非寄生宿主高100倍。一种畸形细胞产生的miRNA（Cve-miR-281-3p）和一种CvBV产生的miRNA（Cve-miR-novel22-5p-1）通过调节宿主蜕皮激素受体（EcR）的表达来阻止宿主生长。研究结果显示miRNA在动物寄生中可以进行跨物种调控，及寄生期间宿主生理改变中miRNA的功能。

研究结果

图1  寄生蜂幼虫和畸形细胞中的miRNA 特征

比对寄生蜂的基因组得到20个由多DNA病毒编码的miRNA，由13个前体miRNA剪切加工形成。

图2  CvBV编码的miRNA在CvBV感染的宿主小菜蛾中的表达。

i.小菜蛾三龄幼虫注射CvBV；j. CvBV加入细胞培养基中进行细胞感染。

RT-qPCR验证20个miRNA，其中17个miRNA可以验证。

图3  RT-qPCR结果表明畸形细胞会释放出特异的miRNA

验证发现畸形细胞所编码的miRNA必须分泌到胞外，并被寄主小菜蛾的血细胞所吸收才能起作用。

图4  Cve-miR-281-3p和Cve-novel22-5p延迟小菜蛾的生长和化蛹。

       对畸形细胞中30个高表达miRNA进行靶基因预测，选择具有同一靶标基因(EcR)进行功能验证。RT-qPCR和免疫印迹检测转录本丰度和蛋白质表达丰度。畸形细胞源的miRNA和CvBV源的miRNA都能作用于寄主小菜蛾蜕皮激素受体（EcR），下调寄主EcR的表达水平及蛋白水平，延迟小菜蛾的蜕皮和化蛹。


结果展示

图1  小RNA分类注释

通过与已知的sRNA数据库比对，鉴定小RNA，各类小RNA所占比例。

图2  差异表达miRNA   

X轴代表比较组，Y轴是对应的小RNA数。绿色代表下调，红色代表上调。

图3  差异miRNA火山图

图中X轴表示差异倍数取log2的值，Y轴表示-log10(FDR)，绿色的点表示显著下调的sRNA，红色的点表示显著上调的sRNA。

图4  差异表达小RNA层次聚类

X轴代表进行聚类分析的差异比对，Y轴代表差异基因。颜色代表差异倍数(颜色越红代表表上调倍数越大，越绿代表下调倍数越大)。

图5  KEGG通路注释分类统计图

横坐标为差异小RNA的靶基因个数，纵坐标表示二级KEGG pathway通路。二级通路又分别属于不同的一级通路，图中用不同颜色表示一级通路类别。

表1  Small RNA组织样品送样建议

表2  Small RNA测序样品判定标准

Q1：小 RNA 测序对样品提取有什么特殊要求？ 

        提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒，也不要使用LiCl沉淀，以免丢失小片段RNA。如果直接提供small RNA样品，可以使用small RNA提取专用试剂盒来进行提取。

Q2：华大可以实现什么类型的样品建库测序？

         动植物总RNA样品、微生物总RNA样品、200nt以内的小片段RNA样品、经切胶回收的small RNA样品、组织培养与细胞系样品、血清/血浆样品、组织液样品，FFPE样品、RIP样品,外泌体样本等，只要满足华大送样要求，均可在华大用于小RNA建库测序。

Q3：为什么实验结果中会存在降解的 rRNA序列？ 

        由于 total RNA 常发生轻微的降解，而生物体内也有自然的降解过程，因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低，并且取决于样品 total RNA 的质量。

Q4：进行小 RNA 测序时，客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息？ 

        需要提供相应物种的基因组和相关的 exon、intron、repeat 信息。如果没有本物种的基因组，需要提供近缘物种的相关信息。