MagCaptureTM 外泌体提取试剂盒
常见问题
• 关于试剂盒的规范、性能
Q1 本试剂盒使用了抗体吗?
A1 没有使用抗体。使用了与金属离子结合和与磷脂酰丝氨酸(PS)结合的蛋白。
Q2 用此款试剂盒可提取什么样的细胞外囊泡呢?
A2 外泌体和大型细胞外囊泡(微小泡)。
Q3 外泌体和微泡的区别是?
A3 外泌体,是来源于晚期胞内体,直径为40-100nm的细胞外囊泡。微泡来源于细胞膜,直径100-1000nm的细
胞外囊泡。
Q4 外泌体和微泡能可以分别纯化吗?
A4 可以。同时纯化的情况下,1200×g离心取上清液。纯化外泌体的情况下,10000×g离心取上清液。只纯化微
泡的情况下,10000×g离心,沉淀置于TBS制成悬浊液备用。样品的前处理请参考操作说明书。
Q5 外壳型病毒也能回收吗?
A5 能。外壳性病毒膜表面也有PS,混入外壳性病毒的样品,所有PS都能回收。需要分离的情况下,使用本试剂盒
回收后,需要用与病毒或者外泌体特异性抗原的抗体纯化。
Q6 所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸(PS)吗?
A6 尚未得到实验验证。通过分析外泌体的膜脂成分证实,有几种细胞(小鼠少突胶质细胞)来源于外泌体。因
此,不会暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌体,而此款试剂不能纯化这种外泌体。但是,使用
该试剂纯化到的外泌体,已确认有多个外泌体标记蛋白,与以单一类型的表面标记蛋白作为抗原的传统亲和方
法相比,以膜脂成分为抗原的该试剂能取得更多种类的外泌体。另外,虽然识别表面标记蛋白的抗体可能无法
识别不同动物来源的抗原,但是该试剂能解决这一问题(人类、小鼠、牛等都能应用)。而且已验证了可以纯
化超速离心时需沉淀才能回收的外泌体。
Q7 该试剂盒的样品是什么?
A7 使用细胞培养上层清液、血清或尿液效果显著。如果血浆中添加了螯合剂(比如EDTA)和柠檬酸,原理上无
法分离外泌体。若要回收,可通过超滤更换缓冲液来回收。具体步骤请看相关资料。由于肝素处理过的血浆回
收率低,从血液样本中回收请使用血清。另外有客户成功从血浆、脑脊髓液中回收外泌体。
Q8 一次能回收多少外泌体?
A8 根据样品的种类和数量有很大的差异,据研究所实验记录,在一次的分离中最多能回收30μg蛋白质(通过
BCA法检测)、1-2×1010粒子(通过纳米技术检测)。(K562培养基中的莫能菌素能促进外泌体分泌,可取
5mL培养上清液进行回收)。
1 mL正常人混合血清能回收5×109颗粒(通过纳米技术检测)。
• 与传统法的比较
Q9 与超速离心法相比好处在哪?
A9 与超速离心法相比,本试剂盒能更简便、重复性好、高效地回收高纯度外泌体。也能回收超速离心法无法沉淀
的外泌体。
Q10 与传统抗体亲和法相比,PS亲和的优势是什么?
A10 采用传统的抗体亲和法是用变性剂进行洗脱,此款试剂盒是在中性环境下用螯合剂来洗脱的,能完整回收外
泌体,不会混入非特异性吸附物,能获得高纯度外泌体,提取纯度更高。传统的抗体亲和法只能特异性识别
一种外泌体表面Marker蛋白质,而本试剂盒是特异性识别膜脂质成分,更能广泛获得外泌体。有事例表明识
别表面Marker蛋白质抗体不能识别不同动物物种的抗原,而本试剂盒能在大范围的动物物种中运用(人,
小鼠,牛等都有报道)。
Q11 与其他方法相比回收的纯度如何?
A11 与传统沉淀法(超速离心法、多聚物沉淀法)相比,纯度更高。与超速离心法和密度梯度离心法相结合的方
法相比,能简便地获得同等高纯度的外泌体。(原因:采用抗体的传统亲和法是用变性剂进行洗脱,因此很
容易混入粒子等非特异性吸附物。然而此款试剂盒是用螯合剂来洗脱的,所以难以混入非特异性吸附物。)
Q12 与其他方法相比回收率如何?
A12 与采用抗体的传统亲和法、超速离心法相比,能获得更高的回收率(低于聚合物沉淀法)。
• 关于试剂盒的操作方法、组成
Q13 操作该试剂盒耗时多久?
A13 (1个小时预处理样品),该试剂盒Exosome Capture 磁珠的固定需要15分钟,然后3个小时的化学反应,
最后15分钟洗脱,总计3小时30分钟。
Q14 本试剂盒需要特别慎重的操作吗?
A14 Exosome Capture 固定化磁珠与样品反应后的清洗步骤中最后需要去除洗净液。完全去除后再进行提取。
提取时在提取液中加入磁珠后,确保磁珠不发生凝集并处于悬浮状态。
Q15 提取液的组成有哪些?
A15 是含有1mM 的螯合剂、盐、防腐剂的Tris基础溶液。若以上成分阻碍后续分析,请使用超速离心膜
(Sartorius公司 VivaSpin500,使用100K分子量截留,Code:VS0141)并替换合适的Buffer。
Q16 Exosome Capture 固定后磁珠可以循环利用吗?
A16 可以。为了能够高效回收样品中的外泌体,试剂盒可完成5次回收实验。试剂盒里的缓冲液只含5次纯化的
量。1mL体积以上样本建议进行浓缩后再回收,纯化时可进行反复抽提,提高纯化效率。详情参考操作说
明书。
Q17 Exosome Capture 固定化磁珠能保存吗?
A17 可以。洗脱出外泌体后的磁珠需再使用,用试剂盒附带的 Washing buffer 或自制的TBS冷藏保存。
Q18 实验要留到第二天需要做什么步骤?
A18 Exosome Capture 固定化磁珠与样品的反应步骤(反应时间3小时)可以过夜(置于4℃下)。
• 关于样品用量
Q19 样品纯化所需的最低量是?
A19 使用旋转器的需要500μL以上,使用离心管混合器的需要100μL。样品量更少的情况下加TBS到所需最低量后
再使用Exosome Capture 固定化磁珠。
Q20 大量的样品能回收吗?
A20 可浓缩后再回收。如果样品是培养上清,可以从体积50毫升的样品中回收外泌体。离心分离预处理后,取
50mL上清液超离浓缩至1mL(推荐Sartorius Viva Spin20 使用100K分子量截留、Code:VS2041)。无
血清培养基和添加了10% FBS的培养基也可以收集外泌体。详情参照操作说明书。因为血清样品无法浓缩,
最多只能用10mL的样品。但是大于1mL的血清回收率低,建议反复提纯。
• 关于外泌体提取后的分析
Q21 外泌体中含有什么?
A21 含有蛋白质、脂质、核酸(DNA、microRNA、mRNA)等。
Q22 提取后的细胞外囊泡可以用什么方法检测?
A22 因为能得到完整的细胞外囊泡,可以使用所有的分析方法。
(例)蛋白质分析:蛋白质电泳、免疫印迹、质谱分析、流式细胞术、ELISA等
核酸分析如:定量PCR、微阵列(生物芯片)、新一代测序等
粒子分析:电镜分析,纳米位点分析(NTA)等
功能分析:体内外的用药实验等
Q23 提取后的细胞外囊泡(EVs)能直接添加到细胞使用中吗?
A23 可以使用,但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影响,参考Q15替换合适的Buffer。使用离心过滤
部件。
(Millipore 公司ΜLtrafree - MC, GV 0.22μm 已灭菌、Code:UFC30GV0S)除菌。
Q24 电镜分析需要外泌体的量是多少?
A24 能用电镜观察到2-4×1010的粒子(通过纳米技术检测)。
Q25 提取出的细胞外囊泡的保存条件是?
A25 冷藏、冷冻保存。长期保存需要放到-80℃。
为避免冻结溶解,冻结保存推荐细分后保存。
Q26 如何做回收的外泌体提取液的免疫印迹?
A26 本公司研究所从回收的100 μL提取液抽取15 μL,加入5 μL 4×SDS样品Buffer,共20μL的样品全量上样进行
SDS-PAGE。用量与宣传册上的免疫印迹的样本量一致。
Q27 Exosome质谱检测的步骤是?
A27 外泌体提取→SDS-PAGE与胶内酶切→通过LC-MC/MS进行蛋白质组学分析
• 关于外泌体标记
Q28 用该试剂盒提取出来的囊泡怎么判断是外泌体呢?
A28 根据表面抗原的抗体(WB)、电子显微镜、密度梯度离心、纳米粒度测量(如NanoSight LM10)等来
验证。
Q29 外泌体分离后用免疫印迹法确认的标记蛋白是什么?
A29 CD9, CD63, CD81, Frotillin-2, Lamp-1等。
• 相关产品
Q30 有在销售和光检测外泌体用的抗体吗?
A30 本公司当前销售以下抗体。
Anti CD9 for Exosome Isolation(Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M01-50UL)
Anti CD81 for Exosome Isolation(Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M03-50UL)
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)(Wako Cat. NO.012-27063)
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)(Wako Cat. NO.016-27061)
Q31 有可以从分离囊泡里提纯RNA的试剂盒吗?
A31 有。可使用microRNA Extractor SP Kit(295-71701)比AGPC法更能高效提纯RNA。
Q32 有销售磁支架吗?
A32 有的。Wako品牌,产品编号290-35591,MagCapture系列磁珠捕获用磁力架。”
Q33 该技术专利是什么?
A33 已申请PCT专利。
Q34 加入什么金属离子?
A34 钙离子
Q35 血浆提取方法是?
A35 请查看相关资料。
Q36 试剂盒中的22支反应管有什么特殊之处吗?用普通的1.5mL离心管可以吗?
A36 该试剂盒中的反应管使用特殊材质,可减少磁珠吸附,该反应管可单卖
A36 BMBio BM-15 Ring Lock Tube 1.7mL 500 tubes/box 1。