无血清/异源成分条件下搅拌式生物反应器连续收集人间充质基质细胞外泌体的平台构建及其治疗应用

本研究针对传统间充质基质细胞外泌体(MSC-EVs)生产工艺存在的规模小、纯度低等问题，开发了基于搅拌式生物反应器(STR)的无血清/异源成分(S/XF)连续收集平台。通过整合切向流过滤(TFF)和阴离子交换色谱(AEC)技术，实现了临床级MSC-EVs的高效制备（产量达2.13×1012个/批次），其粒径(115±4.88 nm)、纯度(5.53×109颗粒/μg蛋白)和生物学活性均符合治疗标准，为细胞无治疗提供了标准化生产方案。

　　

论文解读

研究背景

间充质基质细胞外泌体(MSC-EVs)因其天然的组织修复能力和低免疫原性，已成为再生医学和药物递送领域的新星。然而，传统生产工艺依赖平面培养系统和胎牛血清(FBS)，不仅产量难以满足临床需求（单次治疗需10¹⁰-10¹¹个EVs），还存在异源污染风险。更棘手的是，超速离心(UC)等传统分离方法效率低下，导致产品纯度不足。这些问题如同"三座大山"，严重阻碍MSC-EVs的临床转化。

研究方案

葡萄牙里斯本大学的研究团队在《Stem Cell Research》发表论文，开发了一套整合搅拌式生物反应器(STR)和新型无血清/异源成分(S/XF)培养基的连续生产平台。关键技术包括：(1)采用可溶解微载体在STR中扩增脐带华通氏胶来源MSC(MSC(WJ))；(2)使用γ-辐照处理的外泌体清除人血小板裂解液(hPL-EVd)进行连续3天EV收集；(3)结合切向流过滤(TFF)和阴离子交换色谱(AEC)进行规模化纯化。研究涉及3名健康供体的MSC(WJ)，通过纳米颗粒追踪分析(NTA)、透射电镜(TEM)等技术全面表征EVs特性。

研究结果

静态培养验证连续收集优势
通过对比24小时换液与不换液模式，发现72小时内分次收集可使EV产量提升2.84倍（1.48×10¹¹ vs 5.14×10¹⁰个），且细胞活性保持>98%，证实连续收集策略的可行性。

STR实现高效细胞扩增
优化后的STR系统使MSC(WJ)在7天内扩增30.1倍，达到6.03×10⁷个细胞，细胞密度达5.58×10⁴个/cm²。间歇搅拌策略（5分钟50 rpm/30分钟静止）促进微载体均匀分布，葡萄糖/乳酸浓度稳定在4mM/2mM。

连续生产保持细胞特性
在60 rpm连续搅拌条件下，3天EV收集期间细胞活性未受影响（96.8%），且保持典型表面标志物表达（CD90/CD73>95%）。三系分化实验证实细胞功能完整性。

下游工艺获得高纯度EVs
从600 mL条件培养基中分离获得2.13×10¹²个EVs，平均粒径115 nm，纯度达5.53×10⁹颗粒/μg蛋白。Western blot显示CD9/CD63/syntenin-1阳性而calnexin阴性，TEM呈现典型杯状形态。

功能验证显示治疗潜力
荧光标记EVs可被95%以上的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和乳腺癌细胞(MDA-MB-231/MCF-7)内化，提示其作为药物载体的潜力。

研究意义

该研究首次建立了符合GMP标准的MSC-EVs连续生产平台，其创新性体现在：(1)新型hPL-EVd培养基避免异源污染；(2)STR连续收集使产量达临床需求数量级（10¹²个/批次）；(3)TFF-AEC联用将纯度提升至现有报道的5倍。相比传统方法，粒子产率因子（1.26×10⁴个/细胞/天）提高4-25倍，为治疗急性呼吸窘迫综合征(NCT04602104)等疾病提供了可靠的"现成"治疗产品。未来需进一步通过蛋白质组学分析验证EVs cargo的一致性，并开展功能研究以确认其治疗效能。