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为探究牡蛎免疫机制，大连海洋大学研究人员开展了关于牡蛎中组织蛋白酶 L（CTSL）同源物 CgCTSL-2 的研究。结果发现 CgCTSL-2 能识别灿烂弧菌（Vibrio splendidus）、裂解补体 C3，促进细菌吞噬降解，这对理解无脊椎动物免疫有重要意义。
在神秘的海洋世界里，牡蛎作为一种重要的海洋生物，对维持海洋生态平衡和水产养殖业的发展起着关键作用。然而，近年来，牡蛎养殖业却遭遇了严重的挑战，病原微生物的侵袭让大量牡蛎患病甚至死亡，其中灿烂弧菌（Vibrio splendidus）这一革兰氏阴性致病菌，更是让牡蛎养殖业损失惨重。在牡蛎的免疫系统中，细胞外的补体系统和细胞内的溶酶体过程是抵御病原体的两大重要防线。但长期以来，在无脊椎动物中，组织蛋白酶 L（CTSL）对补体 C3 激活的调控作用却一直是个谜，这就好比在牡蛎的免疫防御 “地图” 上，有一块关键区域是模糊不清的。为了填补这块空白，深入了解牡蛎的免疫机制，大连海洋大学的研究人员勇挑重担，开展了一项关于牡蛎中 CTSL 同源物 CgCTSL-2 的研究。他们的研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》上，为我们揭开了牡蛎免疫防御的神秘面纱。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是实时定量 PCR（RT-qPCR）技术，通过该技术检测 CgCTSL-2 mRNA 在牡蛎不同组织中的分布以及在灿烂弧菌刺激后在血细胞中的表达变化；二是免疫共沉淀（Co-IP）技术，用于验证 CgCTSL-2 与 CgC3 在细胞游离血淋巴和血细胞中的相互作用；三是 RNA 干扰（RNAi）技术，抑制 CgCTSL-2 的表达，进而研究其对 CgC3 的影响；四是流式细胞术（FCM），分析 CgCTSL-2 在血细胞亚群中的分布。
研究结果如下：
- CgCTSL-2 的分子特征：从牡蛎中成功鉴定出 CgCTSL-2，其 cDNA 全长 1433bp，开放阅读框 996bp，编码 331 个氨基酸，预测分子量为 37.05kDa。它包含信号肽、Inhibitor_I29 结构域和 Pept_C1 结构域，与其他物种的 CTSL 有较高相似性，还含有 Ca2+结合位点 “EPA”。
- CgCTSL-2 的表达分布：RT-qPCR 分析显示，CgCTSL-2 mRNA 在牡蛎的鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、肝胰腺、唇瓣和血淋巴等所有检测组织中均有表达，其中在肝胰腺中表达量最高。在灿烂弧菌刺激后，血细胞中 CgCTSL-2 mRNA 的表达在 3 小时显著增加。通过 FCM 和免疫细胞化学分析发现，CgCTSL-2 蛋白分布在血细胞的三个亚群中，主要集中在粒细胞，且定位于细胞质。
- CgCTSL-2 的活性及结合特性：体外表达纯化的 rCgCTSL-2 具有 CTSL 活性。ELISA 实验表明，rCgCTSL-2 能与脂多糖（LPS）结合，且 Ca2+可促进这种结合。微生物结合实验显示，rCgCTSL-2 在 Ca2+存在的情况下，能特异性结合灿烂弧菌，但对其他测试细菌无明显结合。虽然 rCgCTSL-2 对灿烂弧菌没有溶菌活性，但灿烂弧菌可促进 rCgCTSL-2 的活性，且二者在细胞游离血淋巴中存在共定位。
- CgCTSL-2 与 CgC3 的相互作用：Co-IP 实验证实，CgCTSL-2 与 CgC3 在细胞游离血淋巴和血细胞中存在相互作用。在 rCgCTSL-2 处理的牡蛎中，细胞游离血淋巴中全长 CgC3 减少，CgC3b 和 iCgC3b 的 α 链片段增加；在 CgCTSL-2-RNAi 牡蛎中，细胞游离血淋巴和血细胞中全长 CgC3 增加，同时血细胞中 iCgC3b 的 α 链片段和 CgC3γ 也增加。这表明 CgCTSL-2 能裂解 CgC3，促进 CgC3 片段的产生。
- 细菌的降解途径：免疫细胞化学观察发现，灿烂弧菌与 CgC3、CgCD18 在血细胞中存在共定位，CgCTSL-2 与 CgC3、溶酶体也存在共定位。这说明 C3 片段包被的灿烂弧菌可能通过 CgCD18 介导进入血细胞，然后经 CTSL - 溶酶体途径降解。
研究结论和讨论部分指出，本研究首次发现牡蛎中的 CgCTSL-2 能特异性识别灿烂弧菌，并与 CgC3 相互作用，激活 CgC3。激活后的 CgC3 结合细菌，介导细菌经 CgCD18 进入 CTSL-2 - 溶酶体途径进行降解。这一发现为理解无脊椎动物补体系统的激活机制及其在抗菌免疫中的作用提供了重要依据，也为进一步探究补体系统的起源和进化奠定了基础。同时，研究还发现 CgCTSL-2 对 LPS 和灿烂弧菌的结合特性存在差异，暗示可能存在其他未知的结合机制，这也为后续研究指明了方向。
