USP5：多发性骨髓瘤免疫抑制微环境调控的关键靶点 —— 激活 STAT2-PFKFB4介导的糖酵解途径

多发性骨髓瘤（MM）治疗困难，其免疫抑制微环境与肿瘤发展密切相关。研究人员探究 USP5 在 MM 糖酵解及免疫抑制微环境中的作用，发现 USP5 通过激活 STAT2-PFKFB4通路促进 MM 发展，为 MM 治疗提供新靶点。

　　在医学领域，多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）一直是个棘手的难题。它是一种高度异质性的血液恶性肿瘤，复发率高且难以治愈。全球每年新增大量病例，严重威胁着人们的健康。MM 的发展不仅涉及肿瘤细胞自身的遗传改变，骨髓微环境的变化也起着关键作用。肿瘤细胞与骨髓微环境中的各种细胞相互影响，其中巨噬细胞在肿瘤免疫中扮演着重要角色。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages，TAMs）可分为促炎的 M1 型和抗炎的 M2 型。在肿瘤发展过程中，M2 型巨噬细胞增多，会形成免疫抑制微环境，帮助肿瘤细胞存活和增殖。

同时，肿瘤细胞的代谢特点也备受关注。Warburg 效应表明肿瘤细胞倾向于通过糖酵解获取能量，产生大量乳酸。乳酸不仅是代谢产物，还能作为免疫调节物质，影响免疫细胞功能。在 MM 中，虽然知道细胞存在代谢异常，但糖酵解和乳酸生成的具体机制，以及它们对骨髓微环境中巨噬细胞的影响尚不明确。

另外，泛素特异性蛋白酶 5（Ubiquitin-Specific Proteases 5，USP5）在肿瘤生物学研究中逐渐受到重视。它能调节蛋白质的稳定性和功能，在多种癌症中发挥作用。在 MM 中，USP5 已被证明与肿瘤细胞的存活有关，但它是否参与 MM 细胞的糖酵解 - 乳酸生成途径，以及对免疫抑制微环境形成的影响还不清楚。

为了解开这些谜团，井冈山大学附属医院的研究人员开展了深入研究。他们发现，USP5 在 MM 患者和细胞系中异常高表达。敲低 USP5 能抑制 MM 细胞的存活和糖酵解活性，减少乳酸介导的免疫抑制性 M2 样巨噬细胞极化，而过表达 USP5 则有相反的作用。从机制上看，USP5 可通过下调 STAT₂的泛素化修饰来稳定 STAT₂蛋白，进而激活 PFKFB₄的转录。STAT₂能逆转 USP5 对 MM 细胞存活、糖酵解和乳酸介导的免疫抑制性 M2 样巨噬细胞极化的调节作用。这一研究成果发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上，为 MM 的治疗提供了新的潜在靶点，有望开发出更有效的治疗策略。

研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。他们收集了井冈山大学附属医院的 20 名健康骨髓供者和 38 名 MM 患者的样本，分离出相关细胞进行研究。通过细胞转染技术，改变细胞中 USP5 和 STAT₂的表达水平。采用 qRT-PCR 检测基因表达，Western blot 检测蛋白表达。利用 CCK-8 法和流式细胞术分析细胞存活和凋亡情况。还通过相应试剂盒检测糖酵解相关指标，如葡萄糖摄取、乳酸生成和 ATP 水平。

USP5 在 MM 患者和细胞系中异常增强

研究人员对比了 MM 患者和正常供者骨髓样本中 USP5 的表达，发现 MM 患者的初级骨髓瘤细胞中，USP5 在 mRNA 和蛋白水平均显著高于正常供者。在 MM 细胞系中，相对于正常浆细胞系，USP5 表达也更高。而且，缺氧诱导和与骨髓基质细胞共培养会进一步上调 USP5 的表达，这表明 USP5 在 MM 中呈富集状态。

USP5 促进 MM 细胞的增殖、影响凋亡和糖酵解

通过转染 shUSP5 敲低 NCI-H929、INA-6 和 U266 细胞中 USP5 的表达，以及转染 pcDNA3.1-USP5 过表达 MM.1S 细胞中 USP5 的表达，研究发现敲低 USP5 会抑制细胞活力、诱导细胞凋亡，同时下调糖酵解相关基因（HK2、PFKP、PKM2）的表达，减少葡萄糖摄取、乳酸生成和 ATP 含量；而过表达 USP5 则有相反效果，说明 USP5 能促进 MM 细胞存活和糖酵解。

USP5 通过调节糖酵解 - 乳酸途径诱导免疫抑制性巨噬细胞形成

考虑到糖酵解增强会产生乳酸，导致肿瘤微环境酸化，研究人员分析了 USP5 对巨噬细胞极化的影响。使用乳酸脱氢酶 A（LDH-A）抑制剂奥昔酸钠（OXM）处理细胞后发现，敲低 USP5 对乳酸生成的抑制作用在 OXM 处理下加剧，过表达 USP5 的促进作用则被逆转。与肿瘤条件培养基（TCM）共培养的巨噬细胞实验表明，USP5 下调会抑制 M2 样巨噬细胞标记物（Arg1、CD206、IL-10）的表达，OXM 处理会进一步增强这种抑制作用；USP5 上调则增强 M2 样巨噬细胞标记物的表达，但会被 OXM 逆转，而对 M1 样巨噬细胞标记物影响不明显，说明 USP5 通过诱导糖酵解产生乳酸，进而促进 M2 样巨噬细胞形成。

USP5 通过促进 STAT₂去泛素化稳定 STAT₂蛋白

通过数据库预测和实验验证，发现 USP5 对 STAT₂有去泛素化修饰作用。过表达和敲低 USP5 对 STAT₂mRNA 水平无显著影响，但过表达 USP5 会增加 STAT₂和 p-STAT₂（Y690）蛋白水平，敲低则降低。共免疫沉淀实验证实了 STAT₂和 USP5 的直接相互作用。用 CHX 处理细胞后发现，敲低 USP5 加速 STAT₂蛋白降解，过表达则延迟降解。体外泛素化实验表明，USP5 缺失会增强 STAT₂的泛素化水平，上调则降低其泛素化水平，说明 STAT₂是 USP5 在 MM 中的直接泛素化修饰靶点。

STAT₂激活 PFKFB₄转录

通过数据库预测和实验验证，发现 STAT₂能直接结合到 PFKFB₄启动子上。转染 shSTAT₂会下调 STAT₂和 PFKFB₄的表达，转染 pcDNA3.1-STAT₂则上调其表达。染色质免疫沉淀（ChIP）实验和双荧光素酶分析进一步证实，STAT₂能激活 PFKFB₄转录。

USP5 通过上调 STAT₂促进 MM 细胞存活和糖酵解

在 NCI-H929、INA-6 和 U266 细胞中过表达 STAT₂，在 MM.1S 细胞中敲低 STAT₂后进行功能实验。结果显示，STAT₂过表达能逆转敲低 USP5 对细胞活力的抑制和对细胞凋亡的诱导作用，也能逆转敲低 USP5 对糖酵解相关基因表达、葡萄糖摄取、乳酸生成和 ATP 含量的抑制作用；敲低 STAT₂则有相反效果，说明 USP5 通过增加 STAT₂促进 MM 细胞糖酵解和增殖。

USP5 诱导免疫抑制性巨噬细胞形成部分依赖于 STAT₂上调

将不同处理的 MM 细胞的 TCM 与外周血单个核细胞（PBMCs）来源的巨噬细胞共培养。结果显示，敲低 USP5 会抑制 M2 巨噬细胞标记物水平和 CD206 阳性细胞率，过表达 USP5 则增强这些指标。但在 NCI-H929、INA-6 和 U266 细胞中过表达 STAT₂能逆转敲低 USP5 的作用，在 MM.1S 细胞中敲低 STAT₂能减弱过表达 USP5 的作用，说明 USP5 通过调节 STAT₂促进肿瘤相关 M2 巨噬细胞极化。

USP5 在体内促进肿瘤生长、糖酵解和 M2 样巨噬细胞极化

将不同处理的 NCI-H929 细胞与巨噬细胞混合后皮下注射到裸鼠体内。4 周后处死小鼠收集肿瘤组织，发现敲低 USP5 能显著抑制肿瘤生长，减小肿瘤体积和重量。同时，敲低 USP5 会下调肿瘤组织中 USP5、STAT₂、PFKFB₄以及糖酵解相关基因和 M2 巨噬细胞标记物的表达，免疫荧光实验也显示敲低 USP5 会减少 CD206 和 CD11b 的共定位，说明 USP5 在体内促进 MM 发展。

研究结论表明，USP5 通过稳定 STAT₂蛋白，激活 PFKFB₄转录，使 MM 细胞糖酵解和乳酸生成增强，导致免疫抑制性 M2 巨噬细胞形成。这一发现为深入理解 MM 的发展和相关微环境形成提供了新视角，为开发新的抗 MM 策略奠定了理论基础。它揭示了 USP5 在 MM 中的关键作用，提示针对 USP5 的靶向治疗可能成为改善 MM 患者预后的有效方法，具有重要的临床意义。